拟盘多毛孢内生真菌中抗肿瘤活性先导化合物的发现及活性评价

Endophytic Pestalotiopsis genus, one of the special ecological environments fungi, can produce strucutral and bioactive diversity metabolites which play a vital role in developing new antitumor drugs.So far, six Pestalotiopsis species with significant cytotoxic activity were screened from more than forty strains. This project will be arranged as follows: First, monomer compounds will be isolated from six Pestalotiopsis species via fermentation conditions optimization, fermentation in large scale and chemical separation. Then, all monomer compounds will be screened on antitumor activity against HeLa,HEPG-2,A549 and HCT-116 cell lines in viro using MTT method. Finally, siganficant bioactive compounds with high content will be evaluated against H22, Lewis,S180 and People cancer tumors nude mice transplantation cell lines in vivo. The objective of this project is to obtain 15-20 new compounds and 1-2 highly active compounds.

拟盘多毛孢内生真菌作为一类生存环境特殊的微生物类群，其次生代谢产物具有"结构新颖"、"活性独特"等特色，从而使其成为新型抗肿瘤药物创制研究中不可或缺的优质源头分子。目前，申请者已从40余株该属真菌中筛选出6株活性菌株,其发酵培养物的乙酸乙酯萃取物在体外和体内对部分肿瘤细胞株具有较为显著的抑制活性。为此，本项目在此基础上以6株活性菌株为对象，通过发酵条件优化、扩大培养发酵和化学分离得到单体化合物；然后运用现代波谱学技术确定化合物结构；采用MTT方法以人宫颈癌HeLa、人肝癌HEPG-2、人肺癌A549和人结肠癌HCT-116为模型对所有化合物进行体外细胞毒活性筛选；对体外筛选出的含量较大高活性化合物以小鼠肝癌H22、小鼠肺癌Lewis、小鼠肉瘤S180和人癌裸小鼠移植瘤为模型进行动物体内筛选，评价其作为抗肿瘤药物先导结构的可能性。预期分离15-20个新化合物，争取发现1-2个高活性化合物。

拟盘多毛孢属植物内生真菌作为一类特殊的生物资源，由于其能够产生结构新奇和活性多样的天然产物，从而引起了国内外天然药物化学家的关注。本项目以前期发现的6株高活性拟盘多毛孢属真菌为对象，运用生物活性追踪和化学分离相结合的研究策略，从这6株真菌中寻找具有抗肿瘤活性的新结构天然产物，并对高活性化合物的抗肿瘤作用机理进行深入研究。通过本项目的实施，主要完成了以下工作：①运用传统研究方法和新的研究方法（化学遗传表观调控、基因挖掘和宏基因组学技术）相结合的研究策略，系统完成了11株拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)内生真菌、5株其它属真菌和式根岛海绵(Discodermia calyx)宏基因文库的次级代谢产物研究，共分离鉴定了180个单体化合物，其中26个为新化合物；②发现11个化合物对植物病原真菌具有非常强的抑制活性， 6个化合物对人体肿瘤细胞株具有非常显著的抑制活性。通过对1个高活性苯酞类衍生物DMMP抗肿瘤作用机理初步研究表明，发现该化合物可以诱导HeLa细胞出现凋亡特征，同时使线粒体膜电位下降；③运用化学遗传表观调控技术对其它真菌的代谢进行筛选，发现了3株真菌（桦褐孔菌、漆斑菌和韩芝）能够产生新的诱导代谢产物，代谢产物分离正在进行之中；④从特殊环境植物和昆虫中已分离得到100株内生真菌，这将为这为下一步开展工作奠定了工作基础；⑤以tenellin 和demethyltenellin 这两个典型的高度还原聚酮类化合物的合成酶(TenS和DMBS)中CMeT-KR双结构域为研究对象，采用精确基因结构域置换方法开展了对TenS和DMBS甲基化机理研究，发现了控制甲基化的主要活性部分。本项目执行期间，共发表学术论文12篇，其中SCI论文9篇。培养硕士研究生4名，其中2名已毕业。通过本项目研究表明：运用传统研究技术与新的研究策略相结合的研究手段从特殊生境真菌或其它真菌资源中挖掘新结构活性化合物前景广阔，不仅极大地丰富了真菌化学结构多样性，而且为真菌创新药物或先导化合物的发现提供新的发展契机和更大的研究空间。