三种硬蜱雄性附腺防御素的比较研究

Ticks are important vector arthropods, and have attracted much more attention of researchers due to their economic, medical and epidemiological importance. Male accessory gland (MAG) is an important organ of the male reproductive system in ticks, which secretes a great variety of bioactive substances. As an important type of functional molecules in MAG secretions, defensins play significant roles in the immune defense of the reproductive system. Based on the data accumulated in our previous studies on MAG and tick reproductive physiology, this project will put emphasis on the comparative researches on the defensins of the MAG in three hard- tick species of different genera. With the application of a series of modern biological technologies and the cross-disciplinary methodologies, including biochemistry, molecular biology, mass spectrometry, peptidomics, bioinformatics, bioassay and immunology, we will conduct systematic researches on the gene diversity, molecular structure, expression characteristics and antibacterial functions of MAG defensins among the three species of hard ticks, and evaluate the effects of MAG defensins on reproductive processes and explore the immune mechanism of reproductive system in ticks. The above results will undoubtedly facilitate in revealing the reproductive characteristics and physiological adaptation strategies of ticks, and establish a basis in seeking new methods for integrate control of ticks and tick-borne diseases.

蜱类是重要的媒介节肢动物，对其研究具有重要的经济学、医学和流行病学意义。雄性附腺（male accessory gland, MAG）是蜱类雄性生殖系统的重要器官，分泌多种生物活性物质。防御素作为MAG分泌物中重要的功能分子，在生殖系统的免疫防御中发挥关键作用。本项目以不同属三种硬蜱为研究对象，在课题组对MAG和蜱类生殖生理前期工作积累的基础上，综合运用生物化学、分子生物学、质谱学、多肽组学、生物信息学、生物测定和免疫学等现代生物学及其交叉学科的研究技术，对MAG防御素进行深入而系统的研究，比较三种硬蜱MAG防御素的基因多样性、分子结构、表达特征和抗菌功能，研究其在生殖过程中的作用特点，探索蜱类生殖系统免疫机制，为揭示蜱类生殖生物学规律、生理适应对策，寻求蜱和蜱媒疾病防治新途径建立基础。

本项目以不同属三种硬蜱为研究对象，在课题组对蜱类生殖生理学前期工作积累的基础上，综合运用生物化学、分子生物学、质谱学、多肽组学、生物信息学和生物测定等现代生物学及其交叉学科的研究技术，对雄性附腺防御素进行深入而系统的研究，比较三种硬蜱防御素的基因多样性、分子结构、表达特征和抗菌功能，研究其在生殖过程中的作用特点。主要结果如下：（1）通过对cDNA文库进行特异性筛选，在三种硬蜱中分别克隆获得了符合防御素结构特征的基因序列，对已获得的防御素基因序列进行了开放阅读框、等电点、信号肽、成熟肽以及三维结构等方面的分子特征分析。（2）利用Real-time PCR技术分析三种硬蜱防御素基因的表达特征，结果表明森林革蜱防御素基因Ds-defensin-1的表达具有组织特异性，雄蜱中主要在唾液腺和残骸中表达，雌蜱中主要在残骸中表达；长角血蜱防御素基因HP-defensin-1在卵和若蜱中的表达量明显高于幼蜱、成蜱阶段；亚洲璃眼蜱Haa-defensin-1基因在幼蜱阶段的表达量最高；Haa-defensin-2基因在卵中的表达量最高。（3）对三种硬蜱防御素多肽进行抗菌谱、抗菌活力的检测和比较。森林革蜱Ds-defensin-1的人工合成蛋白对革兰氏阳性菌具有较强的抗菌活性，对革兰氏阴性菌也表现出了一定的抗菌活性；经扫描电镜观察，Ds-defensin-1作用于菌体30min后细胞膜表面发生改变，出现颗粒，并伴随内容物外溢，菌体形态出现逐渐卷缩和弯曲，最终导致细胞的破裂和溶解。通过原核表达技术，获得长角血蜱HP-defensin-1的重组蛋白，该重组蛋白对革兰氏阳性菌具有广谱抗菌性，对部分革兰氏阴性菌和真菌也具有一定的抗菌活性。亚洲璃眼蜱Haa-defensin-1和Haa-defensin-2的重组蛋白对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌均有抗菌活性，但存在差异性。（4）在不同菌株的胁迫下，会诱导三种硬蜱防御素基因的上调表达并具有一定的特异性。抗氧化实验结果显示，HP-defensin-1、Haa-defensin-1、Haa-defensin-2的重组蛋白和Ds-defensin-1的人工合成多肽均对ABTS•+和DPPH•自由基具有较强的清除作用，表明其具有抗氧化功能。上述研究结果揭示了蜱类生殖生物学规律和生理适应对策，为寻求蜱和蜱媒疾病防治新途径建立了基础。