铜绿假单胞菌疫苗候选抗原PA0833的结构改造及其免疫保护机制研究

PA0833 is a candidate antigen of Pseudomonas aeruginosa vaccine identified by our group previously based on reverse vaccine technology. It exhibits stronger immunogenicity and protective efficacy than OprF, a candidate antigen that has already been evaluated by clinical trials. The results from passive immunization and B cell knockout mice suggested that PA0833 specific antibody plays a key role in PA0833 mediated protection, but the mechanism remains unclear. Further study revealed that nasal immunization in mice with PA0833 resulted in obvious inflammatory response in lung tissue, and the potential pathogenicity limited its application for vaccine development. In this study, we will construct the PA0833 gene knockout strain and rescue strain of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 firstly, and to verify the pathogenicity of PA0833 by comparative studies with the wild type strain. At the same time, we will determine the crystal structure of PA0833, which will be used as a tool to analyze and identify the key amino acid residues that may be involved in the pathogenicity of the protein. The corresponding mutants will be designed and prepared, and the pathogenicity and protective efficacy of these mutants will be evaluated, in this way to obtain a safe and effective mutant of PA0833 for vaccine development. Finally, we will systematically investigate the mechanism of PA0833 mediated protection. This study will lay a solid foundation for the development of vaccine against Pseudomonas aeruginosa infection.

PA0833是课题组前期通过反向疫苗学技术筛选得到的一个铜绿假单胞菌疫苗候选抗原，在动物实验中表现出良好的免疫原性和免疫保护效果，优于已进入临床试验的疫苗抗原OprF。被动免疫和B细胞敲除小鼠实验结果提示其主要通过抗体介导的免疫应答发挥免疫保护效果，但具体机制并不清楚。进一步研究发现PA0833滴鼻免疫时能够诱发肺组织明显的炎症反应，其潜在的致病性严重限制了其应用。本项目拟在前期研究基础上，构建PA0833基因敲除株和回复突变株，通过与野生株的比较研究，进一步对PA0833的致病性进行验证。同时，解析得到PA0833蛋白的晶体结构，通过结构比对和分析明确其结构表面的关键氨基酸残基等信息，设计制备相应的突变体并对突变体的致病性和免疫保护效果进行评价，得到安全有效的突变体蛋白，在此基础上深入探讨PA0833通过抗体介导的免疫保护的具体机制，为铜绿假单胞菌疫苗抗原的筛选和疫苗的成功制备奠定基础。

PA0833是课题组国家自然科学基金课题（项目批准号：81571621）的资助下，通过反向疫苗学技术筛选得到的一个疫苗候选抗原。该蛋白功能未知，动物实验发现其滴鼻免疫时可以促进小鼠肺部的炎症反应，但其机制并不清楚。在本研究中，我们克隆表达并纯化了该蛋白，通过理化性质的鉴定证明其在溶液状态下形成二体，具有肽聚糖结合活性，进一步通过建模、同源比对和结构生物学研究证实该蛋白为OmpA家族蛋白。同时，我们构建了铜绿假单胞菌标准菌株PAO1的PA0833敲除株，通过敲除株与野生株的对照研究，明确了PA0833对细菌生长代谢的影响。在此基础上，通过组织病理学检测、细胞因子检测等比较肺组织损伤程度和炎症因子差异，通过流式细胞术检测支气管肺泡灌洗液中的炎症细胞类型和数量，证实了该蛋白与细菌致病密切相关，可能是一个新的毒力因子。进一步通过转录组芯片筛选敲除株与野生株感染肺上皮细胞或巨噬细胞后的差异位点，证实PA0833可通过“PA0833→IL-8→中性粒细胞→炎症”轴促进炎症反应的发生，即PA0833识别肺上皮细胞或肺巨噬细胞表面的TLR2受体，活化这些细胞并促进IL-8的分泌，后者趋化中性粒细胞到感染局部导致肺炎的发生。此外，我们发现PA0833敲除后可下调铜绿假单胞菌调控盐藻糖合成相关基因的表达，初步证实PA0833可通过提高盐藻糖的表达增强细菌致病性，目前正在对具体机制进行深入研究。最后，我们已完成PA0833多种截断体制备和评价, 完成蛋白的免疫保护机制研究，证实了该蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护效果，并主要通过体液免疫应答的方式发挥免疫保护作用。以上研究对明确PA0833蛋白的功能、深入探讨铜绿假单胞菌的感染和致病机制，寻找新的药物靶点具有重要的指导意义。目前，在该课题的资助下已发表SCI论文2篇，另有1篇在撰写中，预计2020年完成发表。