幽门螺杆菌精氨酸酶RocF的结构解析与功能研究

精氨酸酶在幽门螺杆菌的感染和致病中发挥了极其重要的作用。它通过和宿主的NO合成酶竞争精氨酸生成尿素和鸟氨酸，间接减少了NO的生成，避免了宿主生成大量的NO对其直接杀伤；其产物尿素是尿素酶生成二氧化碳和氨的重要原料，二者中和胃酸，为幽门螺杆菌的定植提供了便利；它还通过抑制T细胞增殖抑制宿主的获得性免疫。因此，有些文献已经将其列为一种新的致病因子。与其他种属相比，幽门螺杆菌的精氨酸酶在金属离子结合特异性、反应条件方面等都存在很大的不同，提示其空间构象存在差异。本研究拟解析精氨酸酶及其与不同金属离子或底物类似物结合状态下的复合物的晶体结构，获得该蛋白的底物结合部位和酶活中心的构象以及关键氨基酸残基，并设计相应突变体，建立酶活测定体系，通过体内外试验验证这些残基对酶活的影响；同时从结构层面分析不同来源的精氨酸酶活性差异产生的原因，为深入研究其在幽门螺杆菌感染和致病中的作用提供理论基础。

幽门螺杆菌精氨酸酶（RocF）参与了细菌的粘附定植，并可下调宿主的天然和适应性免疫应答，与细菌的持续性感染密切相关。因此，有些文献已经将其列为一种新的致病因子。本研究主要集中于研究RocF的结构与功能，为深入研究其在幽门螺杆菌感染和致病中的作用提供理论基础。.在这个基金的资助下，我们完成了基金申请书中几乎全部的实验内容，取得了以下主要的研究成果。第一：得到了apo状态的幽门螺杆菌精氨酸酶（RocF），建立了其活性测定体系，发现该酶在结合Co2+和偏酸性(pH6.4)条件下具有最强的活性，在溶液中的状态为单体且对还原剂极为敏感，与同源蛋白相比表现出一些特殊的理化和酶学性质。第二：解析得到了RocF的晶体结构，结构分析表明RocF含有一段独特的由13个氨基酸残基组成的插入序列，形成一段额外的α-螺旋，在同源蛋白中不存在。第三：系统的研究了RocF结构与功能之间的关系：①将插入序列缺失后的突变体酶活显著降低，并初步探讨了其可能的作用机制。得到了RocF插入片段缺失突变体和RocF与抑制剂nor-NOHA的复合物的晶体，为后续深入研究插入片段功能奠定了基础；② 证实了RocF 形成独特的单体结构，有别于其它精氨酸酶的三体和六体；③突变和酶学实验证实RocF的C-端和N-端的序列均不足以改变RocF 的寡聚状态和酶学活；④明确了RocF 参与金属离子结合的关键残基及其功能；⑤证实了RocF 结构中不存在二硫键，探讨了还原剂影响RocF 活性的新机制。第四：构建了RocF敲除菌株，为深入研究其功能奠定了基础。第五：发表与RocF直接相关的SCI论文三篇（Int J Biochem Cell Biol, 2013,45(5), 995-1002； PLoS One, 2011, 6(10): e26205； Acta F, 2011,67: 707-709），累计影响影子9.5分，在该课题的资助下还发表了3篇与幽门螺杆菌重要蛋白结构与功能相关研究的SCI论文3篇。