阿维菌素抗性小菜蛾GABA和GluCl受体基因功能的RNAi研究

阿维菌素的杀虫谱之广和活性之强都是堪称划时代的，但目前对于阿维菌素的作用靶标和害虫对阿维菌素的抗性机理尚不明确。本项研究拟以阿维菌素抗性小菜蛾为研究对象，以阿维菌素的可能作用靶标GABA和GluCl受体为研究主体，主要采用RNAi技术研究两种受体在阿维菌素抗性小菜蛾中的功能。通过小菜蛾活体的RNAi，测定dsRNA处理前后阿维菌素对小菜蛾的毒力和生物学特性等方面的变化，通过建立COS-7细胞的受体基因表达和RNAi技术体系，测定表达受体蛋白纯化后与阿维菌素的亲和特性，检测基因沉默前后敏感和抗性受体对阿维菌素亲和力的差异等。综合活体和细胞表达后RNAi的结果，明确阿维菌素对小菜蛾的作用机理，GABA和GluCl受体基因的功能及其对阿维菌素抗性的贡献率，阐明小菜蛾对阿维菌素的抗性机理。研究结果可为阿维菌素抗性小菜蛾的抗性治理和以GABA和GluCl受体为靶标的新型杀虫剂的创制提供依据。

GABA受体的荧光定量分析：同一种群中，GABA基因的表达量随龄期的增长而降低；同一龄期中，抗性种群的相对表达量较低，除第一龄期外，其他各龄期的相对表达量差异显著。. 小菜蛾抑制性谷氨酸受体的RNA干扰：采用RNA干扰技术对小菜蛾IGluR的功能进行了初步研究。结果表明：小菜蛾2龄和3龄幼虫中dsRNA的最佳注射量分别为50.6 nL和71.3 nL。2龄和3龄幼虫在注射dsRNA 36 h和24 h后IGluR基因的转录后水平分别下降了32.67%和49.30%。幼虫发生RNA干扰后对阿维菌素的敏感性结果显示，注射了IGluR dsRNA的幼虫死亡率显著低于对照。结果说明，小菜蛾IGluR是阿维菌素的潜在靶标之一。. 小菜蛾Gluclα 基因的相对表达量和序列分析：各个龄期的相对表达量差异不显著，最高为2.38 倍。抗性小菜蛾品系GluClα 基因序列在氨基酸序列的第61-82 之间出现了2 套替换模式，敏感和抗性品系的单头和挑斑替换率差异不大；针对GluClα 基因核苷酸序列自第1307 位插入了64bp 核苷酸序列，导致翻译提前终止，敏感品系的单头和挑斑插入率均高于抗性品系；在第374 位至第385 位的12 个氨基酸发生稳定性的缺失。抗性品系的单头缺失率（61.11%）和挑斑缺失率（32.20%）均高于室内敏感品系的6.25%和20.00%，表明抗性小菜蛾品系GluClα 基因发生稳定性的缺失明显高于敏感品系。. 小菜蛾IGluR 的电生理研究：通过分别注射GluClα 基因正常和缺失的cRNA，在非洲爪蟾卵母细胞中表达同聚体IGluR。电压钳检测结果表明，注射正常GluClα 基因表达的IGluR（PxIGluR-N）对谷氨酸的 EC50 为52.61uM，而注射缺失GluClα 基因表达的IGluR（PxIGluR-D）对谷氨酸的EC50 为689.7uM。可知，PxIGluR-D 对谷氨酸的敏感性比PxIGluR-N 下降了13.11 倍。当用阿维菌素刺激时，PxIGluR-D的EC50（1146nM）是PxIGluR-N（118.4nM）的9.68 倍，可见，当GluClα 基因发生缺失时，IGluR对阿维菌素的敏感性也降低。表明GluClα 发生缺失可能是导致小菜蛾对阿维菌素抗性的原因之一。