基于核酸代谢的茶树咖啡碱体外从头合成

Adenine, is considered as the most effective precursor substance in the caffeine biosynthetic pathway of Camellia sinensis, whose and the metabolic pathway is list as follows: Adenine→ AMP→ IMP→ XMP→ xanthosine→ 7-methylxanthosine→ 7-methylxanthine→ theobromine→ caffeine. The pathway with AMP as the starting material is called de novo biosynthesis of caffeine and regarded as the main route of caffeine biosynthesis in Camellia sinensis. Although the biosynthesis from xanthosine to caffeine has almost been clear, while the de novo biosynthetic pathway with AMP as the starting material is still unknown up to present. The current project is to reveal the do nevo biosynthesis from AMP to caffeine by the co-expression of the key genes in the eukaryotic cell system. These genes isolated from Camellia sinensis include AMP deaminase, IMP dehydrogenase (TIDH), S-adenosyl-L-methionine synthetase (sAMS), xanthosine methyltransferase (XMT) and caffeine synthase (TCS). Results will not only comprehensively reveal the biosynthetic pathway step by step from purine nucleotides to caffeine in tea plant, but also help us profoundly understand the relationship between nucleic acid metabolism and alkaloid metabolism in higher plants. Meanwhile the obtained research results will provide a theoretical evidence for the molecular breeding of lower-alkaloid tea plants and reference for production of caffeine in vitro in large-scale.

茶树咖啡碱生物合成路径中，腺嘌呤被认为是最有效的前体，其代谢途径为A（腺嘌呤）→AMP (单磷酸腺苷)→IMP(次黄嘌呤核苷单磷酸)→XMP（黄嘌呤核苷单磷酸）→XR（黄嘌呤核苷）→7-MXR（7-甲基黄嘌呤核苷）→7-MX（7-甲基黄嘌呤）→Tb（可可碱）→Cf（咖啡碱）。以AMP为原料合成咖啡碱的过程称为从头合成，是茶树体内咖啡碱的主要合成途径。从XR到Cf合成途径已比较清晰，但以AMP为原料的咖啡碱从头合成研究至今没有突破。申请项目通过在真核细胞中对茶树咖啡碱从头合成过程中关键酶：AMP脱氨酶、IMP脱氢酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、黄嘌呤核苷甲基转移酶和咖啡碱合成酶的基因进行组合表达，实现咖啡碱的从头合成。预期结果将深入揭示茶树中从嘌呤核苷酸转化形成咖啡碱的代谢途径，有助于深入理解高等植物核酸与生物碱代谢之间的关系，为低生物碱茶树品种选育提供理论依据，为体外规模化生产咖啡碱提供参考。

茶树咖啡碱生物合成路径中，从XR到Cf合成途径已比较清晰，但以AMP为原料的咖啡碱从头合成研究至今没有突破。本项目通过对咖啡碱从头合成过程中的关键酶：来源于茶树的AMP脱氨酶（AMPDH）、IMP脱氢酶（TIDH）、S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAM）、咖啡碱合成酶（TCS1）和来源于咖啡的黄嘌呤核苷甲基转移酶（CaXMT）基因进行克隆并进行组合表达。将CaXMT和TCS1在不改变氨基酸序列的前体下进行密码子优化，并将优化后的目的基因eXMT和eCS1在大肠杆菌中诱导表达，研究发现eCS1可以催化多种甲基黄嘌呤生成咖啡碱，且能够利用一条新的黄嘌呤→3-甲基黄嘌呤→茶叶碱→咖啡碱的合成途径。通过过量表达eCS1，实现了咖啡碱的从头合成。在重组菌株BL21/pRSF-eCS1中串联表达酿酒酵母SAM合成酶基因SAM2和编码透明颤血红蛋白的基因vgb，构建了菌株BL21/pRSF-eCS1-eSAM2-evgb；通过提高大肠杆菌中甲基供体SAM的积累，重组菌株经发酵96 h，咖啡碱产量达到（13.95 ± 0.14）mg/L，与重组菌株BL21/pMAL-eCS1相比，提高了117%；在重组菌株BL21/pRSF-eCS1-eSAM2-evgb的基础上进一步串联表达酿酒酵母鸟嘌呤脱氨酶基因eGUD1，提高咖啡碱合成的嘌呤环骨架黄嘌呤的供应，并通过调节基因eGUD1、eSAM2、evgb和eCS1的表达顺序，探究多基因表达顺序对咖啡碱合成的影响。最终重组菌株BL21/pRSF-eGUD1-eCS1-eSAM2-evgb的咖啡碱产量达到（21.46 ± 1.03）mg/L，与重组菌株BL21/pMAL-eCS1相比，提高了234%。同时以谷氨酸棒状杆菌为宿主菌，构建了重组菌株C. glu/pZ8-gGUD1-gCS1，可以实现咖啡碱的合成。研究结果深入揭示了从嘌呤核苷酸转化形成咖啡碱的代谢途径，有助于深入理解高等植物核酸与生物碱代谢之间的关系，为低生物碱茶树品种选育提供理论依据，为体外规模化生产咖啡碱提供参考。项目实施过程中，在国内外学术期刊中发表高水平研究论文7篇（已标注基金号），其中 SCI论文5篇（包括中科院一区论文2篇），申请了四项发明专利（二项已经授权，另二项在实审中），参加国际学术会议2次，培养青年教师1名，研究生4名。