免疫蛋白酶体β5i通过调节线粒体功能保护心肌缺血/再灌注损伤的分子机制研究

Mitochondrial dysfunction is an important mechanism of myocardial ischemia/ reperfusion (I/R)-induced apoptosis. Proteasome (including constitutive form and inducible form) is the main way of protein degradation regulation. Constitutive proteasome is involved in the degradation of apoptosis-related proteins and I/R-induced myocardial apoptosis. However, the role of immunoproteasome, particularly β5i subunit, and the molecular mechanisms in myocardial I/R injury is unclear. Our preliminary results indicate the expression of β5i protein is significantly reduced in the cardiac myocytes after I/R. However, the over expression of β5i by adenoviral transfection can significantly inhibit I/R-induced myocardial apoptosis, reduce the expression of apoptosis-related proteins and improves chondriokinesis. In the present study, using primary cultured myocardial cells transfected by adenovirus with β5i overexpression or knockdown β5i by siRNA, and mice I/R model with transgene or knockout of myocardial cell-specific β5i gene, taking mitochondrial injury (including abnormal fusion and fission), oxidative stress, inflammation and apoptosis into account, we aim to study: the molecular mechanisms through which I/R injury down regulate the expression of β5i; The role of β5i in I/R-induced myocardial injury and the underlying signal paths as well as molecular mechanisms. The objective is to provide novel research directions and therapeutic targets for the prevention and cure of I/R-induced myocardial injury.

线粒体功能异常是心肌缺血/再灌注（I/R）损伤细胞凋亡的重要机制。蛋白酶体（包括组成型和免疫型）是调节细胞蛋白质降解的主要途径。其中组成型蛋白酶体参与凋亡相关蛋白降解及I/R心肌细胞凋亡已有报道。但是免疫型蛋白酶体特别是其β5i亚基在心肌I/R损伤中的作用及机制不清楚。我们预实验结果表明在I/R心肌细胞中β5i蛋白表达明显降低。而腺病毒转染过表达β5i可明显抑制I/R诱导的心肌细胞凋亡及其相关的凋亡蛋白表达，并显著改善线粒体分裂。本课题拟应用腺病毒过表达β5i或siRNA转染的乳鼠心肌细胞、心肌特异转β5i基因和敲除小鼠的I/R模型，以线粒体损伤（包括融合与分裂异常）、氧化应激、炎症反应及细胞凋亡为切入点进一步研究：①I/R损伤下调β5i表达的分子机制；②β5i在I/R诱导的心肌损伤中的作用；③β5i保护心肌I/R损伤的信号通路及分子机制。为心肌I/R损伤的防治提供新的研究方向和治疗靶点。

急性心肌梗死（AMI）及心房颤动（房颤）是严重危害人类健康的重大心血管疾病。蛋白酶体（包括组成型和免疫型）是调节细胞蛋白质降解的主要途径。其中组成型蛋白酶体参与凋亡相关蛋白降解及缺血再灌注（I/R）心肌细胞凋亡已有报道，但是免疫型蛋白酶体特别是其β5i亚基在心肌I/R损伤及心房重构和房颤发生中的作用及机制尚不清楚。因此，本课题的研究内容主要分为两部分：（1）研究了免疫蛋白酶体β5i在心肌I/R损伤中的作用。主要发现缺氧/血后，心肌细胞或心肌组织中β5i表达水平显著降低；在培养的心肌细胞中过表达β5i明显抑制缺氧引起的细胞凋亡和线粒体分裂；相反，敲低β5i加重细胞凋亡和线粒体分裂。与野生小鼠比较，β5i转基因小鼠表现心脏功能损伤、心肌梗死面积、纤维化面积和细胞凋亡均明显改善；相反，这些作用在β5i敲除小鼠中进一步加重。其分子机制主要是β5i降低了calcineurin A 的降解，引起其下游靶蛋白Drp1活性增高，促分裂蛋白Fis-1增高，抑制分裂蛋白mfn-1/2 蛋白降低，导致线粒体分裂增加，ROS产生过多和细胞凋亡。这些结果为阐明心肌梗死的分子机制提供了新的实验依据，β5i可作为治疗心肌梗死的一个新靶点。(2) 研究了免疫蛋白酶体β5i在心房颤动中的作用机制。主要发现在Ang-Ⅱ注射小鼠及房颤病人血清中，催化亚基中β5i的表达及其糜蛋白酶样活性上调最为明显。与野生对照小鼠相比，β5i基因敲除能够显著抑制Ang-Ⅱ诱导的房颤发生、心房纤维化、炎症反应及氧化应激；相反，β5i转基因小鼠中上述反应增加。此外，本研究还发现，AT1R受体相关蛋白（ATRAP）是β5i作用的靶点。在β5i转基因小鼠中，过表达ATRAP能够明显降低心房重构及房颤的发生，其机制主要是Ang-Ⅱ上调β5i表达，从而促进ATRAP降解，使AT1R介导的NK-κB信号通路激活，增加NADPH氧化酶活性，促进TGF/β1/Smad信号通路激活，从而改变Kir2.1及CX43在心房的表达，最终导致心房重构及房颤的发生。. 总之，本研究提示β5i可作为防治心肌梗死/损伤及房颤的潜在新药物靶点。