L-异亮氨酸羟化酶在4-羟基异亮氨酸发酵中的应用基础研究

As a hydroxylating derivative of L-isoleucine, 4-Hydroxyisoleucine (4-HIL) exhibits glucose-dependent insulinotropic biological activity and functions of decreasing plasma triglycerides and total cholesterol. Thus 4-HIL is an effective drug that could be administrated chronically to control and cure diabetes, glycaemia and body weight gain. In this project, the key enzyme for 4-HIL synthesis, L-isoleucine-4-hydroxylase(IDO) of high activity and thermostability will be introduced into L-isoleucine producing strain YILWΔodh. Through extension of L-isoleucine metabolic pathway, YILWΔodhA can transform L-isoleucine to 4-HIL. The main contents are as follows: ① Cloning and identifying a variety of high activity- and thermostability- IDO; studying the key sites or sequences relating with activity and thermostability by sequence alignment, 3-D structure modeling and analysis of enzymatic properties; screening more efficient and thermostable IDO by site-directed mutagenesis. ② Introducing improved IDO into L-isoleucine producing strain YILWΔodhA and studying the effect of IDO transcriptional level on 4-HIL production. This project will lay theoretical foundation and practical basis on the microbial manufacture technology of 4-HIL and provide new ideas in the production of other amino acid derivatives.

4-羟基异亮氨酸（ 4-Hydroxyisoleucine, 4-HIL）具有葡萄糖依赖的促进胰岛素分泌和脂肪代谢以及降血脂等功能，是治疗糖尿病及肥胖病的理想药物。本项目采用代谢工程技术在L-异亮氨酸生产菌 YILWΔodh 中导入4-HIL合成关键酶--高活性热稳定L-异亮氨酸羟化酶（L-isoleucine-4-hydroxylase，IDO），通过L-异亮氨酸代谢途径的延伸，实现4-HIL的直接发酵合成。主要研究包括：①克隆多种耐热菌的高活性热稳定IDO编码基因，通过序列比对、三维结构模拟及酶学性质分析，研究与酶活性和热稳定性相关的关键位点；通过定点突变筛选获得活性和热稳定性更高的IDO；②将改造的IDO编码基因导入L-异亮氨酸生产菌，研究不同表达强度对4-HIL积累的影响。本项目研究将为4-HIL的微生物发酵生产技术奠定理论基础并提供实践依据，为其它氨基酸衍生物的生产技术改进提供具有参考价值的新思路。

4-羟基异亮氨酸具有葡萄糖依赖的促进胰岛素分泌和脂肪代谢功能，对I型和II型糖尿病均具有防治作用。L-异亮氨酸羟化酶能够特异性地催化L-异亮氨酸生成4-羟基异亮氨酸，但活性不高是制约其应用的主要因素。针对已有的L-异亮氨酸羟化酶活性较低、热稳定差的问题，从工厂高温废水排放区土壤中筛选获得236株耐热芽孢杆菌，其中24株含L-异亮氨酸羟化酶编码基因ido，其中3株所含L-异亮氨酸羟化酶氨基酸序列（3个酶氨基酸序列一致）与已报道B. thuringiensis strain 2-e-2存在差异，酶学实验表明该酶能够特异性地催化L-异亮氨酸生成4-羟基异亮氨酸，其Km和Vmax分别为0.18 mmol/L和2.10 μmol/min/mg，最适反应温度和pH分别为35℃和7.0，于35℃条件下处理5 h后仍具有85.1%的活性，其催化效率和最大反应速率及热稳定性均优于后者。为了获得活性更高的L-异亮氨酸羟化酶，建立了依赖于L-异亮氨酸合成与ɑ-酮戊二酸氧化偶联的高效筛选体系，结合易错PCR手段获得4个活性提高的L-异亮氨酸羟化酶突变体。选取活性提高最明显的突变体IDOM3进行序列分析，发现由Ile27、Asp80、His169和Asp182突变为Leu27、Glu80、Gly169及Ser182，其中位于预测活性中心的Gly169和Ser182是引起其活性改变的主要因素。酶学实验表明，IDOM3的活性和热稳定性较突变前均显著提高。将idoM3转化至异亮氨酸生产菌C. glutamicum YILW，利用代谢工程手段成功构建4-羟基异亮氨酸合成途径，在此基础上采用增强ɑ-酮戊二酸合成代谢流并阻断其降解途径策略，同时对比了idoM3不同方式和表达强度对4-羟基异亮氨酸的影响，发现利用lac启动子以质粒表达的形式效果最好，获得的菌株发酵60 h可合成4-羟基异亮氨酸20.1g/L。在达到预期目标的基础上，将idoM3应用于大肠杆菌并开发出酶法合成4-羟基异亮氨酸工艺，16 h内产量达到35.9 g/L，摩尔转化率大于99 %。目前该工艺于河南巨龙生物工程股份有限公司进行中试化生产。本项目能够为ɑ-酮戊二酸依赖型羟化酶的筛选和应用提供参考，同时可为4-羟基异亮氨酸及其他氨基酸羟化物的生物合成提供重要依据。