通过调控巨核细胞甲基化促进ITP患者血小板生成的实验研究

It has been discovered that ITP patients have impaired DNA methylation.Treatment against DNA methylation may provide new therapeutic strategies for this disease. DNA-hypomethylation has been reported to have a clinically significant, often long lasting effect on the platelet count in myelodysplastic syndromes(MDS). Recently, one study reported that DNA-hypomethylation could increase platelet counts by enhancing megakaryocyte maturation and platelet release. However, the effects of DNA-hypomethylation in ITP remain poorly understood. Our previous study showed that both CD8+T cells and the plasma from ITP patients inhibited in vitro megakaryocyte apoptosis, resulting in less polyploidy cells and platelet release. In these megakaryocyte, we also observed a lower expression of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL) and a higher expression of Bcl-xL. In this project, we will use in vitro megakaryocyte culture and chronic ITP mouse model as targets, trying to find the effects of DNA-hypomethylation on megakaryocyte maturation and platelet production in ITP and its possible mechanisms.

ITP患者细胞存在DNA甲基化异常，调控DNA甲基化有望开辟ITP治疗的新领域。目前DNA去甲基化已成为MDS治疗的重要手段，在升高血小板方面疗效尤其显著。研究发现：DNA去甲基化能通过促进巨核细胞成熟和血小板释放来提升血小板数目。DNA去甲基化在ITP治疗中的作用国内外尚无报道。我们前期分别观察了ITP患者CD8+T细胞及血浆对体外巨核细胞生成的影响，发现二者均能引起巨核细胞凋亡受抑，并伴有成熟障碍及血小板生成减少。进一步研究发现在ITP患者血浆的作用下，巨核细胞内Bcl-xL表达升高，TRAIL表达降低，且对巨核细胞的抑制作用与自身抗血小板抗体无关。本项目将以脐血CD34+细胞来源的巨核细胞体外培养和ITP小鼠模型为对象，探讨DNA去甲基化对巨核细胞及血小板生成的影响，明确其在ITP中的治疗作用及具体机制，寻求ITP治疗的新靶点。

免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）是一种以血小板减少伴皮肤黏膜出血为特点的获得性自身免疫性出血性疾病，占所有出血性疾病的1/3。其发病机制主要包括（1）体液免疫异常和细胞免疫异常共同介导的血小板破坏过多；（2）自身免疫紊乱引起的巨核细胞成熟障碍和血小板生成不足。因此，ITP的治疗选择主要包括抑制血小板破坏和促进血小板生成释放两个方面。研究显示许多自身免疫性疾病存在基因组DNA异常甲基化，且这种异常的甲基化参与自身免疫性疾病的发病。ITP作为一种自身免疫性疾病，同样存在DNA甲基化异常，针对DNA甲基化的治疗有望为ITP的治疗开辟新的领域。地西他滨（decitabine, DAC）是一种胞嘧啶类似物，是特异的DNA甲基化转移酶抑制剂，用于治疗骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）。国外多项临床研究结果证实地西他滨可有效改善MDS患者的总反应率、总生存率及生存质量，尤其在升高血小板方面具有显著疗效。最近有研究发现地西他滨能够通过促进巨核细胞成熟和血小板释放两个方面提升血小板数目，且前者可能与巨核细胞中DNA去甲基化有关。DNA去甲基化治疗有可能通过调控巨核细胞成熟和凋亡等作用调节血小板的生成和释放。我们在体外分离培养脐血来源的CD34+细胞，加入不同浓度的地西他滨，通过检测培养体系中巨核细胞和血小板数量，多倍体巨核细胞的比例及巨核细胞凋亡等确定地西他滨的最佳作用浓度。在培养体系中加入10%的ITP患者或正常健康对照血浆及最佳浓度的地西他滨，通过检测上述指标观察地西他滨对ITP血浆抑制巨核细胞成熟、凋亡和血小板生成的影响。我们发现低剂量地西他滨能够有效改善部分ITP血浆导致的巨核细胞成熟、凋亡障碍及血小板生成不足。地西他滨通过降低巨核细胞中肿瘤坏死因子相关性凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL）启动子区甲基化水平增加TRAIL表达，并能促进巨核细胞成熟和血小板释放。另外我们还进行了体内研究，与体外实验结果一致。低剂量地西他滨促进巨核细胞成熟和血小板释放的作用可能对ITP的治疗有益，为去甲基化药物用于治疗血小板减少性疾病提供理论依据。