紫花苜蓿根系响应盐胁迫的分子机制及重要耐盐基因克隆与功能分析

Research on the mechanism of salt tolerance in alfalfa has important significance to improve the genetic resources and utilization ratio of saline soil in arid area. Single transcriptome and proteome analysis on salt tolerance in alfalfa is superficiality, which can not complete analysis of key molecular mechanisms of salt stress response. The materials of this study are Zhongmu No.1, the salt tolerant alfalfa variety, and Atlantic, the salt sensitive variety. Using high-throughout RNA-Seq and iTRAQ building the transcriptome and proteome information platform of alfalfa, to analyse the different transcriptome expression on different alfalfa root system in response to salt stress. At the same time, to correlation analyze the differential expression genes carrying out the functional annotation of differential expression genes and protein, metabolic pathway analysis, Q-PCR gene expression validation and molecular regulatory networks analysis. Obtain the transcriptome of the resistance gene of salt type alfalfa. Explore the mechanism of alfalfa in response to salt stress combining gene expression pattern. Explore the candidate genes related to salt tolerance and identify their functions in order to lay a theoretical foundation for the further analysis of the molecular mechanism and explore genes of salt tolerance in alfalfa. It is a great significance to design the molecular breeding, select and cultivate varieties of salt tolerant.

开展紫花苜蓿耐盐分子机理研究对开发紫花苜蓿遗传资源、充分利用干旱和盐渍化土地具有重要意义。单纯从单个编码蛋白基因策略或单个组学进行研究具有片面性,无法完全解析盐胁迫应答的关键分子机制。本研究以紫花苜蓿耐盐基因型中苜一号和敏盐基因型大西洋为实验材料，利用高通量RNA-Seq与iTRAQ测序技术，搭建紫花苜蓿转录组和蛋白质组信息平台，分析不同耐盐性紫花苜蓿根系响应盐胁迫转录组和蛋白质组的表达差异，同时对差异表达基因与蛋白进行功能注释、代谢通路与分子网络等关联分析，获得紫花苜蓿应答盐胁迫的表达谱，结合基因表达模式，从基因到蛋白质多层次地初步揭示紫花苜蓿根系响应盐胁迫的分子机制，发掘相关耐盐候选基因并鉴定分析其功能，为深入解析紫花苜蓿耐盐分子机制、系统挖掘其耐盐优异基因奠定理论基础，对紫花苜蓿耐盐品种的分子育种设计、耐盐良种选育和栽培提供技术支撑。

由于紫花苜蓿遗传信息缺乏，目前对其耐盐机制的研究仍处于初级阶段，对耐盐性不同的紫花苜蓿基因型盐胁迫的转录组和蛋白质组学关联分析，为紫花苜蓿耐盐分子机制的研究、耐盐基因的挖掘提供新的视角。本研究从转录组学和蛋白质组学水平上，分析盐胁迫下不同耐盐性紫花苜蓿根系响应盐胁迫的基因与蛋白差异表达的相关性，同时对差异表达基因与蛋白进行功能注释、代谢通路分析、Q-PCR 基因表达验证与分子调控网络等相关性分析，研究紫花苜蓿盐胁迫的应答反应，结合基因表达模式初步分析紫花苜蓿根系响应盐胁迫的分子机制；发掘与耐盐相关的候选基因，以优质牧草紫花苜蓿为材料，对紫花苜蓿IPT基因进行了克隆与功能研究，不同逆境表达模式分析发现，IPT基因对干旱、NaCl、NaHCO3、ABA以及H2O2均有不同程度的响应，在根系中的表达量高于叶片。通过启动子序列分析，发现了多个含有响应环境逆境胁迫的作用元件，烟草亚细胞定位表明该基因在细胞膜和细胞核均有表达。采用同源克隆技术，对IPT全长进行了克隆，构建了植物过表达载体并转化了拟南芥，转基因拟南芥在干旱处理后，其存活率、生物量和根长显著高于野生型材料，推测IPT基因可能通过提高植物的根长来增强植株的抗旱性。IPT基因耐盐性效果不显著。对重要耐盐基因进行全长克隆与不同逆境胁迫下的定量表达分析，应用基因工程手段，进行融合蛋白亚细胞定位，开展耐盐基因遗传转化拟南芥研究，并对受盐诱导的耐盐基因进行初步的功能鉴定分析，为深入解析紫花苜蓿耐盐分子机理、系统挖掘其耐盐优异基因等奠定了基础，对紫花苜蓿耐盐品种的分子育种设计、耐盐良种选育和栽培具有重要意义。