质膜H+-ATP酶磷酸化在低温信号传导中的作用及与果实冷害的关系

冷害是植物在低温逆境下的生理失调现象，蛋白激酶介导的蛋白质磷酸化在低温信号的传导过程中起重要作用。本项目在已有研究成果基础上，以冷敏型'扁花'柿果实为试材，围绕其蛋白激酶DkCDPK及其对质膜H+-ATP酶的磷酸化作用两个核心问题，综合运用生理、生化和分子生物学的方法，探索果实冷害发生与DkCDPK介导的质膜H+-ATP酶磷酸化作用的关系，同时分离纯化该蛋白激酶，研究其生物学特性，并进一步从基因转录、蛋白质表达和酶活性三个层次揭示低温对该蛋白激酶的影响，阐明它在冷害发生中的作用机制。本项目首次研究果实中蛋白激酶介导的H+-ATP酶磷酸化与冷害发生的关系，探索采后果实低温信号传导的新途径。研究成果既可有助于人们了解蛋白激酶及其磷酸化作用在植物低温信号传导中的作用，又可丰富和完善植物冷害发生的生物学理论，为调控果蔬冷害保鲜技术提供理论依据。

低温不仅是影响植物生长和发育的重要环境因子，也是延迟采后农产品组织衰老的重要手段，低温冷藏仍然是至今最有效和安全的延长采后鲜活果蔬贮藏期的重要技术措施。本课题对我国冷敏型‘扁花’柿果实采后冷害进行了较为系统的研究。主要研究结果有：柿果实采后果胶酯酶活性迅速上升，其活性与果实硬度的下降呈明显的负相关。β-半乳糖苷酶活性迅速增加，其活性与果实硬度的下降呈明显的负相关，纤维素酶活性呈逐渐上升趋势，与果实硬度的下降也呈明显的负相关。伴随着细胞壁水解酶活性的增加，果实原果胶和纤维素含量迅速下降，而水溶性果胶含量则迅速上升。贮前热激处理延缓了冷藏柿果实脂氧合酶活性的上升，其棕榈酸和硬脂酸的相对含量低于对照，而亚油酸和亚麻酸相对含量反而高于对照，并降低柿果实冷害指数，但对油酸相对含量则无明显影响。 贮前热激处理也提高了冷藏柿果超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶及谷胱甘肽还原酶活性，降低了超氧物阴离子自由基生成速率和MDA含量。这些结果表明，热激减轻柿果冷害可能与抑制脂氧合酶活性和提高果实亚油酸和亚麻酸相对含量有关，还可能与提高活性氧清除酶活性及降低活性氧积累有关。在这些研究成果基础上，进一步研究发现‘扁花’柿果实冷害的发生与质膜H+-ATP酶为靶蛋白的磷酸化作用密切相关，分析了部分纯化柿果DkCDPK的生物学特性和对H+-ATP的磷酸化位点，发现该蛋白激酶的分子量为58kD，具有钙结合性、自动磷酸化和磷酸化H+-ATP酶。DkCDPK的磷酸化和自动磷酸化受到Ca2+ 的刺激而受到EGTA的抑制，显示该蛋白激酶具有钙依赖性。柿果中DkCDPK基因的表达受到低温处理的诱导，通过Northern bolt、Western blotting和磷酸化反应放射自显影技术，从基因转录水平、蛋白质表达水平和激酶活性三个不同层次探讨低温对柿果体内该蛋白激酶的影响，揭示了DkCDPK介导的H+-ATP酶磷酸化在柿果冷害信号传导中的可能模式。相关研究成果已在《Food Chemistry》、《Journal of Agricultural and Food Chemistry》、《Postharvest Biology and Technology》和《园艺学报》等期刊公开发表论文8篇，其中SCI收录5篇，EI收录1篇，获省部级成果奖1项，授权国家发明专利2项，培养研究生6人。