DDT在中华白海豚细胞内富集代谢规律及其诱导细胞凋亡的分子机制研究

DDT is now listed as endocrine interferon and possible carcinogen. The Indo-Pacic humpback dolphin (Sousa chinensis), on top of the chain, is year-round resident in Pearl River Estuary (PRE). Previous studies have found that there were high concentration of DDT in Sousa chinensis from PRE. S. chinensis may be threatened by DDT due to the high accumulation level. However, the studies on the accumulation and metabolism of DDT in S. chinensis cells and the mechanism in apoptosis are still very limited. This project is designed to investigate the regularity of DDT accumulation and metabolism in S. chinensis skin fibroblast (ScSF), and the effect of mitochondrial pathway, and the regulation of Bcl-2 on mitochondrial pathway in apoptosis of ScSF cells, and to reveal the causes of activation and molecular mechanism of mitochondrial pathway in apoptosis of ScSF cells. The culturing technique of ScSF cells in vitro, laserscanning confocal microscope by fluorescence probe, quantitative ELISA, molecular hybridization, flow cytometry, immunohistochemistry and electron microscope are exploited. The objective of the study is to provide scientific basis for the protection of S. chinensis, and to assess the potential health risk of DDT in cetaceans.

滴滴涕（DDT）是一类含有机氯的杀虫剂，被列为内分泌干扰素以及可能的致癌物。中华白海豚是珠江口常年性栖息的鲸豚，处于食物链的顶端。前期研究表明，珠江口中华白海豚体内富集了高浓度的DDT，推测其可能受到较为严重的DDT威胁。目前，对于DDT在中华白海豚细胞水平的富集规律及其细胞毒性效应研究十分有限。因此，本项目以中华白海豚皮肤成纤维（ScSF）细胞为研究对象，通过DDT暴露，检测DDT及其代谢产物在细胞内、外残留水平，揭示DDT在ScSF细胞内的富集效率与转化规律。并采用免疫组化、qRT-PCR、荧光探针激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等研究方法，从细胞和分子水平探讨线粒体信号通路在DDT诱导ScSF细胞凋亡中的作用、Bcl-2家族蛋白对线粒体凋亡通路的调控作用以及线粒体介导的凋亡途径被激活的分子机制，为中华白海豚保护以及DDT对鲸豚健康潜在风险的评估提供科学依据。

滴滴涕（DDT）是一类成分中含有有机氯的杀虫剂，目前己被列为内分泌干扰素以及可能的致癌物。中华白海豚由于近岸分布，且处于食物链的顶端，其体内易富集高浓度的 DDT，因此受到 DDT 的威胁也比较严重。前期研究表明， 珠江口中华白海豚对 DDT 具有高富集能力。但是，目前对于 DDT 在中华白海豚细胞富集及其细胞毒性效应的研究仍十分有限。本项目以中华白海豚皮肤成纤维细胞（ScSF）为主要研究对象，研究发现p,p'-DDT对ScSF细胞具有双剂量效应：低浓度p,p'-DDT（28 μM）提高细胞活力，更高浓度p,p'-DDT（> 56 μM）抑制细胞活力。p,p'-DDT对ScSF细胞的IC50, 72 h（94.1 μM）。p,p'-DDT（> 56 μM）导致ScSF细胞S、G2期抑制，下调其周期相关蛋白CDK1、CDK4、Cyclin B1、Cyclin D1表达水平。p,p'-DDT显著增加ScSF细胞凋亡比例，上调p53、Caspase-3蛋白表达水平。p,p'-DDT上调ScSF细胞Caspase-9和Caspase-8表达水平，表明p,p'-DDT同时激活线粒体和死亡受体凋亡途径。线粒体保护剂可部分降低p,p'-DDT导致的ScSF细胞凋亡，但不能显著恢复ScSF细胞活力，表明线粒体不是p,p'-DDT暴露致毒的唯一途径。Caspases抑制剂和p53抑制剂部分缓解p,p'-DDT对ScSF细胞的毒性。p,p'-DDT通过死亡受体和线粒体途径诱导ScSF细胞凋亡。ScSF细胞可富集p,p'-DDT（14 - 42 μM），并将其代谢为p,p'-DDE和p,p'-DDD。低浓度p,p'-DDT（< 56 μM）提高ScSF细胞总抗氧化能力和过氧化氢酶（CAT）活力。高浓度p,p'-DDT（≥ 112 μM）降低ScSF细胞总抗氧化能力、CAT酶活力、SOD酶活力，提高MDA、ROS、NO水平，上调JNK和p38蛋白水平，表明p,p'-DDT导致ScSF细胞氧化应激。抗氧化剂可部分缓解p,p'-DDT对ScSF细胞的毒性。NO合成酶抑制剂可减轻p,p'-DDT对ScSF细胞的毒性。较低浓度p,p'-DDT暴露提高ScSF细胞抗氧化能力，较高浓度p,p'-DDT导致细胞氧化应激。本项目研究结果为中华白海豚保护以及 DDT 对鲸豚健康潜在风险的评估提供了科学依据。