Serp-2 调控apoptosis和pyroptosis 对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用研究

Liver ischemia-reperfusion (LIR) has clinical relevance to liver transplantation, partial hepatectomy. Studies suggesedt that apoptosis is the major patter of cell death after LIR. The eukaryotic cell' active and self-damage 'process is called programmed cell death (PCD), including apoptosis and pyroptosis. Caspase-8/-/9-/ -l0 are essential in cells for apoptosis. Pyroptosis is a caspase-1-dependent cell death showing similarities to apoptosis. The inflammasome refers to large multiprotein complexes that sense intracellular danger signals via NOD-like receptors (NLR). Inflammasome activation leads to auto-activation of the inactive pro-caspase-1 precursor into two subunits that form the active caspase-1, resulting in the cleavage of pro-IL-1b and pro-IL-18 into mature forms, accompanied by loss of plasma membrane integrity and lack of chromatin condensation. Serp-2 is an intracellular myxoma viral serpin that targets granzyme B, a serine protease,cysteine proteases and caspase-1 and 8. Therefore, in present study, the standard mice mode of LIR need to be established, and then to explore the effect of Serp-2 on LIR in vivo and vitro by using the ShRNA to silence the associated genes expression and gene knockout mice, after that to identify the mechanisms for Serp-2 protecting liver after LIR by two pathways of apoptosis and pyroptosis, finally to illustrate the preventive and treatment function of Serp-2 on intestine after congestion resulting from blockage of hepatic hillar.

肝脏缺血再灌注损伤可导致肝细胞死亡。真核细胞程序性死亡包括apoptosis和pyroptosis等模式。caspase-8/-/9-/ -l0参与apoptosis信号传导。pyroptosis是一种依赖caspase-1的死亡模式。胞浆中的炎性体活化caspase-1后可加工分泌IL-1b和IL-18细胞因子，介导细胞发生肿胀破裂。Serp-2是Myxoma 病毒来源的蛋白酶抑制剂，抑制granzyme B，丝氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶，caspases-1 和8。本研究首先建立标准化的动物模型, 在此基础上体外采用shRNA基因沉默方法和基因敲除小鼠在体外探讨Serp-2对肝脏缺血再灌注损伤的作用, 然后从apoptosis和pyroptosis两条路径探索Serp-2的作用机制, 最后研究Serp-2对肝门阻断后小肠淤血再通畅损伤的防治作用, 为Serp-2的临床应用奠定理论基础

肝脏I/R损伤是一个复杂的病理生理过程，了解肝脏I/R损伤的机制对于制定治疗策略及改善肝脏手术预后十分重要。细胞焦亡是近年来发现的一种依赖于Caspase-1的新的细胞死亡方式。当受到各种危险信号刺激时，细胞内的PRRs通过识别PAMPs和DAMPs组装成有活性的炎性体，并将Caspase-1转变为活性形式。活化的Caspase-1能促进炎性细胞因子IL-1β和IL-18的成熟和释放，诱发严重的炎症反应。同时，Caspase-1还可引起Gasdermin D蛋白裂解并释放其N端结构域，介导细胞发生焦亡。Serp-2蛋白是Myxoma病毒来源的蛋白酶抑制剂，对凋亡和焦亡都具有抑制作用，因此我们选择了Serp-2作为治疗肝I/R损伤的手段。在本项目研究过程中，我们首先使用“结扎法”成功建立了C57/BL6小鼠70%肝I/R损伤模型，并在小鼠肝脏缺血90min再灌注12h后收集血清检测肝功能指标。结果表明实验组小鼠肝功能损伤程度明显高于对照组，H&E染色观察发现实验组出现大量肝细胞变性、凋亡、坏死及炎性细胞浸润。随后我们分别使用RT-PCR和Western Blot技术检测实验组和对照组中细胞焦亡相关基因和蛋白的表达情况，结果发现实验组中NLRP3、Caspase-1和GADMD等焦亡相关基因和蛋白的表达均较对照组明显升高，这表明细胞焦亡参与了肝脏I/R损伤。接着我们使用Serp-2进行治疗，结果显示Serp-2可抑制炎性细胞向损伤组织的浸润，显著提高肝脏I/R损伤后小鼠的存活率。综合上述结果，本研究初步证明了由Gasdermin介导的细胞程序性坏死——细胞焦亡不仅参与了肝脏I/R损伤的整个过程，并在其中发挥着重要的作用；Serp-2蛋白对于肝脏I/R损伤具有十分显著的保护效果。这一发现为探讨肝脏I/R损伤的机制和制定治疗方案提供一个全新的视角，也为Serp-2蛋白尽快应用到临床中奠定了坚实的研究基础。项目资助已录用CSCD 文章1篇，发表会议摘要3篇，待发表英文文章3篇。培养博士研究生1名，硕士研究生3名。