流感病毒不同亚型/毒株NS1拮抗宿主细胞天然免疫效应差异的关键基序研究

流感病毒NS1是一种与流感病毒毒力有关的蛋白，它不仅能够和多种胞内蛋白结合，而且能够和流感病毒其它成分相互作用，从而产生复杂的生物学效应，不同流感病毒亚型或毒株的NS1蛋白存在一定的变异。因此，从病毒与宿主相互作用的角度，根据不同来源的NS1与宿主细胞组分相互作用及其生物学效应的差异，进一步系统明确NS1蛋白在感染与免疫生物学效应的关键基序及氨基酸位点，对理解NS1蛋白的功能，以及更深入地理解流感病毒的致病机制具有重要作用。为此我们选取14种有代表性的流感病毒NS1蛋白，旨在通过系统的比较和分析，利用不同亚型/毒株来源的NS1蛋白在影响宿主细胞抗病毒天然免疫方面的效应差异，通过生物信息学分析、基序氨基酸预测位点突变，在重组蛋白和重组病毒层面，进一步系统明确决定NS1蛋白在感染与免疫生物学效应的关键基序及氨基酸位点，以期全面深入地理解流感病毒NS1在病毒致病性及拮抗宿主免疫效应的作用与角色。

非结构蛋白1（nonstructural protein 1，NS1）是流感病毒一种非常重要的多功能调控蛋白，与病毒毒力密切相关，但NS1具有显著的毒株差异性和细胞差异性。本课题研究了不同流感病毒亚型/毒株的NS1蛋白异源二聚体相互作用。通过酵母双杂交GST pull-down、co-IP及共定位实验结果表明，流感病毒的NS1不仅仅会形成同源二聚体，不同的毒株NS1蛋白间亦可形成异源二聚体，研究了不同亚型流感病毒NS1蛋白与PI3K/Akt通路在病毒复制中的作用。除A/Chicken/Gd/1/05(H5N1)来源的NS1外，其它的实验毒株NS1均可以结合并激活PI3K/Akt通路，H5N1实验毒株的NS1可以结合PI3K的p85β亚单位但不能激活该通路，表明NS1蛋白激活PI3K/Akt通路并非流感病毒保守性状，利用抑制PI3K/Akt通路来进行抗流感病毒的研究策略可能不奏效。建立了流感病毒复制相关荧光酶报告系统和双分子荧光-能量共振转移高通量筛选平台，对抗流感病毒药物进行了初步筛选、药效学分析、NS1及其它致病蛋白作用实验。H3N2病毒中NS1蛋白存在ISG化修饰，K41是重要的且主要的ISG化位点，ST/602/06（H3N2）毒株NS1会发生明显的ISG化修饰。我们在HEK293T细胞中过表达ST/602/06毒株的NS1蛋白24小时后，NS1定位于核仁，引起细胞中Caspase-3的大量表达、p53的表达量显著增加、pre-r RNA表达量显著减少，诱导较强程度的凋亡，提示在核仁中大量表达的NS1与核仁中的重要蛋白质可能发生相互作用，造成细胞核中发生病理性变化，引起细胞的凋亡效应。在H7N9毒株NS1抑制宿主细胞免疫的研究方面，我们克隆A/chicken/Zhejiang/DTD-ZJU01/2013 (H7N9) NS1基因转染A549细胞，能抑制IFN-β介导的先天性免疫反应，导致STAT1表达下调，进而抑制促炎因子CXCL10和CCL5的表达；促凋亡基因Bak、Bad和Bid表达显著增加，激活caspase 3/7的活性，提示H7N9/NS1能够引起A549细胞的凋亡。本课题资助研究结果发表论文8篇（SCI7篇），培养博士研究生3名、硕士研究生2名。课题顺利完成预定研究计划。