环境雌激素对单细胞内雌激素受体作用的原位、动态、定量研究

本课题拟建立集单细胞进样、捕获、细胞孵育、荧光显微成像、溶膜、标记抗体-雌激素受体（ERα）复合物的电泳分离及激光诱导荧光在线检测等多个步骤于一体的微流控芯片平台，实现环境雌激素己烯雌酚作用前后，单个细胞内ERα分布和表达量的原位、动态、定量研究。采用带有围堰的芯片结构，静压力与电渗流驱动相结合的流控技术实现单细胞的进样捕获及各种溶液的顺序引入。采用两种不同颜色量子点标记的抗ERα抗体分别对己烯雌酚作用前后细胞内的ERα先后进行特异性识别和标记，并在对作用后细胞内的ERα进行标记时引入链霉亲和素-生物素，创新性地实现了既可提高方法的灵敏度，有利于新表达的少量ERα的成像与测定，又能使两种标记物的分子量差别拉大，有效地实现电泳分离的双重目的。此方法的建立将为分子水平上探究环境雌激素的生理作用、致癌机理，确定环境雌激素作用的"关键窗口"，并为肿瘤预警和早期诊断提供有效的分析方法。

本项目未能完全按照申请计划执行，对部分研究计划内容作了详细研究，并在此基础上拓展了研究方向，取得了以下成果：.一、对 乳腺癌循环肿瘤细胞的捕获方法进行了研究：分别建立了两种体外捕获检测CTCs的方法——微流控芯片法和膜过滤联合磁分离法，及一种基于留置针输液过程的在体捕获检测CTCs的方法。所建立的微流控芯片法对三种芯片结构进行了优化，对CTCs捕获效率为40-50%。建立了一种快速便携的CTCs捕获及检测方法——基于尺寸放大的免疫磁珠法，联合采用尺寸放大膜过滤与免疫磁分离方法，同时实现了高效率（> 78%）、高纯度（> 98%）及快速（< 2 h）简单的CTCs捕获与检测。建立了一种基于留置针输液过程的CTCs在体捕获与清除方法。可成功捕获注射到野生鼠、兔子及裸鼠静脉中的DAPI标记MCF-7细胞，注射到裸鼠静脉5个细胞时，可成功捕获2个，由裸鼠血液总量计算得出最低捕获及检出限为2个细胞/mL血液。此方法有效避免了CTCs分布不均匀造成的体外捕获检测方法的取样误差，提高了分析准确度和灵敏度。此捕获与清除操作是伴随输液过程同时进行的，不会引起额外的身体损伤，容易被患者接受。这种简单、快速、损伤小的在体捕获方法可随着留置针的广泛应用而普及。.二、完成了桔霉素免疫亲和柱的制备研究：合成了桔霉素免疫原，分别制备出高亲和力的抗桔霉素多克隆抗体及高吸附容量的CuII聚合物。将抗桔霉素抗体结合到嵌合CuII的固定相上，装入固相萃取柱制成免疫亲和柱，用于富集净化红曲红和红曲米两种发酵食品中的桔霉素，并采用高效毛细管电泳法进行分离检测。.三、对雌激素受体的微流控芯片免疫电泳方法进行了研究：建立了一种基于微流控芯片免疫电泳-激光诱导荧光测定MCF-7细胞中ERα含量的分析方法。得到线性方程为y = 9.226+ 0.176x，r2 = 0.9857，线性范围为1.88×10-9 ~ 2.268×10-7 mol/L，最低检出限为9.4×10-10 mol/L。实现了对MCF-7细胞匀浆中ERα含量的测定。