人工合成新型腺病毒及其作为疫苗载体的研究

近20年来，生命科学的迅猛发展极大地推动了新型疫苗的研究。新型疫苗载体成为新型疫苗研究中的热点，与抗原以及佐剂一并成为新型疫苗的重要组成成分。黑猩猩型腺病毒载体由于能同时诱导B细胞和T细胞免疫反应、诱导的免疫反应稳定持久、易于制备、无需添加佐剂、且不受人群中已有人血清型腺病毒中和抗体的影响，成为目前最有应用前景的疫苗载体。本研究以黑猩猩型腺病毒为参照，人工合成新型黑猩猩型腺病毒基因组，用基因组直接克隆法构建新型重组腺病毒以及腺病毒载体。以此新型重组腺病毒载体为基础，并以多种亚型流感病毒的保守基因LAH为靶抗原，制备成新型腺病毒多价流感疫苗。利用小鼠以及雪貂为动物模型，检测新型流感疫苗的免疫反应及免疫保护效果，探讨新型流感疫苗的免疫保护机制。以期获得一种全新的高效腺病毒载体以及新型广谱型流感疫苗，为通用型流感疫苗的研究提供新策略及实验依据，为疫苗研发提供一种全新、高效的载体平台。

腺病毒是目前最有应用前景的疫苗载体之一，被广泛应用于各种预防性或治疗性疫苗的研究。由于腺病毒具有较多的血清型，不同血清型具有不同的生物学特性，因此，分离、鉴定并构建具有良好病毒载体特性的新型腺病毒载体需要大量的人力与物力。为探索并建立一种克隆腺病毒载体的新方法并验证其作为疫苗载体的有效性，我们采用生物信息学分析手段并结合合成生物学、分子生物学等技术，设计一条全新腺病毒基因组，人工合成该序列，将其克隆成一种新型腺病毒载体，以此为基础，研发新型多价流感疫苗以检验该新型载体的有效性，从而为疫苗载体设计和疫苗研发提供新策略。. 通过本项目实施，我们设计出一个类似黑猩猩型的E1/E3删除的复制缺陷型腺病毒基因组，即AdS1，并将其分为6个片段合成序列，克隆至pNEB193载体，获新型腺病毒载体rAdS1，经鉴定，我们成功获得一株新型重组腺病毒。这一结果表明通过生物信息学分析结合合成生物学，可获得一种新病毒并可改装成新型病毒载体，从而为基础研究和疫苗研发提供一种有效的技术平台。在此过程中，我们还发明了一种构建重组腺病毒载体的快速、高效的新方法，即腺病毒载体等温重组法，该方法是重组腺病毒分子克隆中重要的技术革新。. 由于以上获得rAdS1的生长特性存在一定问题，限制其成为一种理想的腺病毒载体，我们需进一步分析并修改其基因组。为顺利完成预定研究任务，我们采用本实验室拥有自主知识产权的新型腺病毒AdC68为载体，设计多价流感疫苗。策略之一是筛选具有抑制流感病毒复制能力的microRNA并以AdC68作为转运载体，以此作为一种新颖广谱的抗流感策略，该研究结果证明靶向流感保守基因NP和M的miRNA可作为流感防控的新手段。策略之二是以AdC68结构蛋白Fiber展示多种流感病毒亚型的M2e作为新型广谱疫苗，结果显示该重组腺病毒能诱导M2e特异性抗体,并有效拮抗致死剂量的H1N1、H5N1、H9N2等流感病毒的攻击感染。因此，腺病毒Fiber展示技术可作为新型通用流感疫苗有效的研发平台。在本项目部分资助下，我们还验证了重组腺病毒表达靶向肿瘤特异性基因的miRNA可作为一种有效的抑瘤手段，进一步拓展了腺病毒载体的应用范畴。. 综上，我们完成了本项目的研究任务，实现了研究目标，为新型腺病毒载体的构建以及广谱流感疫苗的研发提供了新策略和科学依据。