Hedgehog通路调控长链非编码RNA对胰腺癌增殖侵袭的影响及机制研究

Hedgehog（Hh）信号通路与胰腺癌的发生发展有重要相关性，其与非编码RNA特别是长链非编码RNA（lncRNAs）的相互调控日益受到重视，但作用机制仍不明确。前期研究中我们成功筛选出两条受Hh通路调控的胰腺癌特异性lncRNAs，证实其参与胰腺癌细胞增殖及侵袭能力的调控。本课题拟研究2条lncRNAs在胰腺癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性；设计体内外实验评价其对胰腺癌细胞增殖、侵袭能力的影响并探讨其机制；研究靶向lncRNAs干预和抗Hh通路活性对胰腺癌细胞增殖及侵袭的抑制作用；分析鉴定lncRNAs特异结合蛋白，明确其效应机制；应用荧光素酶报告基因研究两种lncRNAs是否直接受Hh信号活性调控。本课题旨在评价2条lncRNAs与胰腺癌生物学行为的相关性并明确其与Hh信号通路的调控关系，探索以lncRNAs和Hh信号通路为靶标的抗肿瘤治疗临床应用的可行性。

长链非编码RNA 作为一种重要的调控分子，在许多肿瘤中异常表达。经过基因芯片分析，我们发现四种lncRNA：HOTAIR、H19、MEG3和MALAT1在胰腺癌中的表达有显著差异。H19作为高度保守的印迹基因，在许多肿瘤的发生发展中均起了重要的作用，但与胰腺癌的关系尚缺乏足够的研究。通过对30例胰腺导管腺癌（PDAC）的冰冻切片进行激光捕获显微切割分离高纯度的肿瘤组织，并成功提取25例样品的RNA后，发现H19在PDAC中显著高表达。临床病理因素分析显示，与高中分化的PDAC相比，低分化的肿瘤有更高的H19表达量。H19在8种胰腺癌细胞系中的表达水平也有不同程度的升高。为进一步研究H19在PDAC中的功能，选择高表达H19的细胞系T3M4和PANC-1下调其H19表达；选择低表达H19的细胞系COLO357和CAPAN-1上调其H19表达。多种功能学实验显示，H19下调后，细胞的增殖、迁移和侵袭能力均受到抑制；而上调H19表达后，细胞的增殖能力明显增强。体内实验证实，下调H19的细胞成瘤明显较小。流式细胞术检测细胞周期变化发现，下调H19可引起G0/G1期阻滞。在细胞周期调控中起重要作用的E2F-1与H19存在相关性，下调H19表达后可同时下调E2F-1的蛋白水平。同时，E2F-1下游与细胞增殖相关的靶基因也发生了相应的改变。免疫组化结果显示，与正常胰腺组织相比，PDAC中E2F-1表达量显著升高，并且与H19的表达水平有一定相关性。不仅如此，通过与E2F-1结合来阻止细胞进入S期的Rb信号通路的活性也受H19表达水平的影响，其可能与E2F-1共同参与了H19对胰腺癌细胞增殖的调控。H19的转录产物miR-675在胰腺癌组织、血清及细胞中的表达水平出现明显变化。在PANC-1中上调miR-675的表达后抑制了细胞增殖，同时细胞自噬增强；下调miR-675的表达后则起到了相反的结果。综上所述，H19在PDAC中发挥了原癌基因的作用，其可通过调控E2F-1影响细胞周期变化而促进细胞增殖。目前课题组已培养9名博士研究生，获得博士学位；在读5名科研型博士研究生、4名临床型博士研究生和1名临床型硕士研究生正在进行该项目研究。课题研究阶段，2名课题组成员赴德国Ulm大学进行学术交流及成果展示。课题组已发表四篇SCI论文，两篇中文论文分别被中华胰腺病杂志、中华外科杂志录用。