以Clusterin为靶点逆转卵巢癌化疗耐药、抑制演进的新策略及其分子机制的实验研究

多药耐药是卵巢癌化疗失败最常见和最难克服的问题。探讨卵巢癌细胞耐药的分子调节机制，有助于寻求更有效的手段攻克肿瘤耐药的难题。Clusterin基因的表达受到pre-mRNA选择性剪接机制的调控，产生具有细胞保护作用sCLU（胞质型）和促进细胞凋亡nCLU（胞核型）两种蛋白亚型。我们在前期工作中发现卵巢癌细胞胞浆中sCLU蛋白表达增加与其耐药、转移、演进密切相关。本项目拟应用RNAi技术等策略特异性阻断胞浆中sCLU表达，从蛋白水平、细胞水平、动物水平三个不同层次，研究Clusterin不同蛋白亚型对于卵巢癌细胞化疗耐药、转移、演进及凋亡的影响，分析其作用机制。本研究有望进一步阐明卵巢癌细胞产生化疗耐药的机理，同时为临床寻找新的肿瘤治疗方法提供实验依据，研究结果有着重要的理论与实际意义。

本项目共分三个年度完成。第一年度实验结果证实：卵巢癌细胞中不同Clusterin蛋白亚型的表达取决于其不同的Clusterin mRNA序列，不同亚型蛋白功能各异，并且与其细胞内定位密切相关。其中：胞浆中sCLU蛋白的高表达具有促进肿瘤细胞生长，诱发细胞耐药功能；胞核中的nCLU则能够通过诱发G2/M期阻滞，诱导细胞凋亡。胞浆中无活性状态的pnCLU蛋白的表达对细胞表型无明显影响，但是随着外界因素的加入（顺铂），pnCLU蛋白高表达使细胞对药物的敏感性增加，考虑可能与pnCLU的激活、入核有关。第二年度运用RNAi效应特异阻断Clusterin基因对人卵巢癌细胞增殖的影响。结果提示：利用RNAi技术，构建特异性的CLU-shRNA真核重组载体，能够有效的阻断卵巢癌细胞中Clusterin RNA及sCLU蛋白的表达，并因此显著抑制肿瘤细胞的生长、增殖，降低细胞耐药性。第3年度首先研究了阻断Clusterin基因对人卵巢癌细胞化疗耐药、侵袭、迁移能力的影响，其次对sCLU蛋白应用于卵巢癌的血清学诊断和判断预后进行了实验性研究，结果提示： RNAi技术阻断卵巢癌细胞中sCLU蛋白表达可显著下调细胞的侵袭、迁移能力，抑制肿瘤演进。sCLU蛋白在卵巢癌患者血清学中含量明显提高，其敏感性83%、特异性77%。进一步实验证实以Clusterin基因为靶点的卵巢癌基因治疗、临床检测的可行性、优越性。.综上所述：.1 胞浆中sCLU蛋白表达增加在卵巢癌发生、发展、演进、耐药、转移中发挥重要的调控作用；位于胞核内nCLU蛋白的聚集则具有诱发细胞凋亡的功能。.2 sCLU在卵巢癌中的表达与细胞耐药密切相关、小剂量顺铂作用下其表达被诱导上调，结合sCLU蛋白的细胞保护性功能，我们推测卵巢癌细胞中sCLU的高表达在其获得性耐药中发挥重要的功能。.3 sCLU蛋白在卵巢癌患者血清学中含量明显提高，其含量与肿瘤分期正相关。..在本项目的资助下，共发表SCI收录论文6篇，国内期刊论文3篇，培养硕士研究生1名。本项目在理论成果、论文发表与人才培养方面均完成了预期的研究目标。.本课题的完成将为探讨卵巢肿瘤发生、发展、耐药、转移的可能机制提供一种新的思路与方法；并为临床卵巢癌的早期筛查、病情监测，以及逆转耐药、抑制转移提供一种新策略。对卵巢癌耐药、转移机制及早期临床检测等研究具有重要的理论与实际意义。