以ERK2为靶点抑制关节囊挛缩的实验研究

纤维性关节僵硬主要由关节粘连和关节囊挛缩引起，是关节及其周围损伤或手术后的常见并发症，给患者肢体带来很大的功能障碍。寻求一种能够预防纤维性关节僵硬的理想方法成为国内外研究的热点。我们在前期实验中发现ERK2是一个预防关节粘连的理想的靶点。关节囊挛缩和关节粘连有着类似的病理变化过程，在关节囊挛缩的早期TGF、FGF和PDGF等生长因子同时升高，通过激活ERK2而刺激肌成纤维细胞增殖和分泌胶原蛋白以及α平滑肌肌动蛋白，从而导致关节囊挛缩，因此我们也可以推测ERK2是一个预防关节囊挛缩的理想靶点。本课题拟通过实验证实我们的推测，我们构建大鼠关节囊挛缩模型，检测关节囊中磷酸化ERK2的变化，并把慢病毒ERK2小干扰RNA注入关节腔，检测其是否能抑制关节囊挛缩。如推测证实是成立的，下一步我们可开发针对ERK2的药物同时来抑制关节囊挛缩和关节粘连。

根据既往文献分析，ERK-2可能在创伤后关节囊挛缩中扮演着重要角色。在一个大鼠创伤后关节囊挛缩模型上，我们研究抑制ERK-2的表达和磷酸化是否能减轻创伤后关节囊的挛缩程度。大鼠被随机分成3组：对照组；创伤后关节囊挛缩组；治疗组。我们造成膝关节腔内损伤，然后在屈曲位固定8周，以制造创伤后关节囊挛缩模型。而在治疗组，我们在第3天和第7天往损伤的膝关节内注入慢病毒ERK2小干扰RNA( siRNA)。在第8周处死大鼠，收获后关节囊作为标本，用western blotting分析ERK2和p-ERK2的变化，用免疫组织化学分析肌成纤维细胞数量的变化，分析I型 和 III型胶原蛋白的总和容量以及III型胶原蛋白所占的比例，对膝关节的活动度进行生物力学分析。结果显示创伤后关节囊挛缩组的p-ERK2较对照组明显增加，这种增加在第2周达到高峰，第4周和第8周逐渐下降，而经过治疗组处理后ERK2及p-ERK2明显下降 (与对照组比较)。相应的，肌成纤维细胞、I型 和 III型胶原蛋白的总和容量呈现同样的变化 (p < 0.01)。而创伤后关节囊挛缩组的膝关节活动度和III型胶原蛋白容量较对照组明显下降，经过治疗后又明显恢复 (p < 0.01)。我们的结果证实了磷酸化ERK-2在创伤后关节囊挛缩中扮演着重要的角色，也许可以作为一个治疗关节挛缩的药物靶点。接着我们研究塞来昔布对成纤维细胞增殖、胶原蛋白分泌、ERK1/2和SMAD2/3磷酸化的影响。我们用塞来昔布来处理培养的NIH/3T3成纤维细胞，然后用FGF-2和TGF-β1进行刺激。用MTT检测NIH/3T3成纤维细胞的增殖水平，用RT-PCR和 western blotting检测ERK1/2和SMAD2/3的蛋白表达水平，用western blotting检测ERK1/2和SMAD2/3的磷酸化蛋白水平。结果显示塞来昔布能够通过抑制ERK1/2的磷酸化水平而不是表达水平而抑制FGF-2和TGF-β1刺激的NIH/3T3成纤维细胞增殖（p < 0.01）。塞来昔布也通过抑制SMAD2/3的磷酸化水平而不是表达水平而抑制TGF-β1刺激的胶原蛋白表达（p < 0.01）。结果证实了塞来昔布能通过抑制ERK1/2和SMAD2/3的磷酸化而抑制成纤维细胞的增殖和胶原蛋白分泌，也许塞来昔布可以通过以上机制而抑制关节囊挛缩形成。