拟南芥钙依赖型蛋白激酶CPK32参与开花时间调控的机制研究

Ca2+ is an important second messenger in eukaryotic signal transduction pathway. Calcium-dependent protein kinases (CDPKs or CPKs) are Ser/Thr protein kinases and found in plants and some protest, which regulate many processes of plant growth, development, synergy of carbon and nitrogen metabolism, adaptation to environmental challenges and the pathogen defense reaction. The previous work in our lab has indicated that atcpk32 mutant had flowering-late phenotype compared to wild-type plant under long-day and short-day conditions. The complementary and overexpression lines of AtCPK32 showed similar phenotype in flowering time as the wild-type plant. Flowering inhibitator FLC has higher expression level in atcpk32 than in wild type. It implied that AtCPK32 maybe participate in the regulation of plant flowering time through autonomous pathway. The purpose of this project is analyzing the regulation using genetic materials of AtCPK32 and exploring its function mechanism in regulating Arabidopsis thaliana flowering time. The prospective results of this project would provide the theory and approach for crops' cultivation in different growth period.

Ca2+是植物营养所必须的二价阳离子，同时作为第二信使参与植物细胞的多种信号转导过程。钙依赖型蛋白激酶（CDPKs）是植物和部分原生动物特有的一类丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，参与了植物生长发育调控、植物碳氮代谢的协同作用、植物对逆境胁迫响应以及病原防御反应等多个过程，在植物Ca2+信号转导中具有重要作用。前期实验结果表明：atcpk32在长/短日照条件下表现出明显的晚花表型，其恢复突变和过表达材料的开花时间与野生型相当。Northern Blot结果显示拟南芥开花抑制因子基因FLC在atcpk32突变体材料中转录水平明显升高，推测AtCPK32可能通过自主途径参与拟南芥开花调节过程。本项目拟以AtCPK32为研究对象，探究钙依赖型蛋白激酶AtCPK32在调节拟南芥开花过程中的作用，阐明其参与植物开花时间的调控机制，为进一步利用基因工程方法培育不同生育期作物提供理论基础和实验依据。

Ca2+在植物体内广泛存在，在维持体内电荷平衡中起着重要的作用，它不仅是重要的结构成分，还作为重要的第二信使参与植物细胞的多种信号传递过程。作为重要的钙感受器蛋白，CDPK参与了植物生长发育调控、植物激素信号转导、营养代谢、病原菌防御反应及对各种生物胁迫和非生物胁迫的响应等过程。.开花是植物由营养生长到生殖生长的重要转变，是植物发育成熟的标志。成花诱导的成功与否直接关系到其后代的延续，其对于种子的形成也至关重要。在农业生产应用上，作物适时的开花对于引种、育种、稳产和增产都有重要的意义。已有研究表明：植物的成花诱导受到精细而复杂的调控，以确保植物在最适的条件下开花、结实。.表型观察发现：cpk32突变体在长日照和短日照光周期条件下均表现出比野生型明显的晚花表型，并能正常地响应春化处理以及GA处理，初步排除CPK32通过光周期途径、春化途径和GA途径起作用，推测CPK32通过自主途径参与拟南芥开花时间的调控。Northern blot分析表明：自主途径关键调节因子FLC的表达量在cpk32突变体中显著升高，同时其下游的开花促进因子FT和SOC1的表达量降低。cpk32突变体材料中降低FLC的表达 (cpk32 flc) 能够逆转cpk32突变体的晚花表型，说明CPK32通过自主途径抑制FLC的表达参与拟南芥开花时间调控。.酵母双杂交、Pull-down实验及双分子荧光互补实验证明CPK32能够与FCA互作，体外磷酸化实验证明CPK32能够磷酸化FCA蛋白的C端结构域。Northern blot实验结果表明cpk32 fca双突变体中FLC的表达量与fca突变体中的FLC表达量较为接近，说明CPK32调节FLC表达与FCA在同一条遗传通路上。FCA能够调节自身前体mRNA的剪切加工。RT-qPCR实验结果发现cpk32突变体中有功能的FCA-γ转录本的比例降低，而无功能的FCA-β转录本的比例升高，说明CPK32能够影响FCA对自身前体mRNA的加工。.综合以上实验结果我们得出：CPK32通过自主途径促进拟南芥开花；CPK32通过与FCA蛋白在细胞核内互作，并通过磷酸化FCA的C端结构域影响FCA的调节功能，导致体内FCA-γ/FCA-β比例升高，抑制FLC的表达，使得FT和SOC1表达水平升高，从而促进拟南芥开花。