从肝论治阿尔茨海默病-黑逍遥散对其模型药靶部位影响的基因和蛋白质表达谱分析

本研究基于从肝论治AD的假说及前期药效学研究基础，进一步以Aβ1-40建立大鼠AD模型，以疏肝养血体现治肝之法的代表方黑逍遥散干预，测试学习记忆行为，并提取分离血清、脑脊液和海马组织标本，检测血清、脑组织SOD、MDA、LPO、GSH-Px、MAO和ChAT。抽提脑海马组织mRNA后用cDNA基因芯片杂交扫描，检测各组cy5、cy3荧光信号，以SNK-t检验方法比较各组数据，应用二项分布原理分析功能基因的表达差异。将海马和脑脊液的蛋白质进行2D电泳和凝胶图像分析，分析比较蛋白斑点差异，测算蛋白分子的等电点和相对分子量，获得基因和蛋白质表达谱并联合分析寻找差异位点，进一步印证从肝论治AD的科学有效性，探讨黑逍遥散的作用机制和药靶部位，以期为防治AD提供新的理论依据，为扩大传统古方新用，研究有效新药提供基础。

项目摘要：目的：观察黑逍遥散对Aβ25-35诱导AD 模型大鼠行为学、形态学、相关酶学的影响，并应用基因芯片和蛋白质质谱芯片技术发现黑逍遥散干预AD 模型大鼠的作用靶点，并对部分靶点和信号通路进行验证，从而探讨黑逍遥散防治AD的作用及其机制。方法：采用Aβ25-35海马区注射诱发复制大鼠AD模型；Morris水迷宫观察AD大鼠行为学变化；比色法测大鼠血清和脑匀浆SOD、MDA、GSH-PX活性；ELISA法测定脑匀浆中AchE、ChAT活性和MAO含量；ELISA法测定了大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量；HE染色法观察海马病理损伤；电镜观察各组大鼠海马组织超微结构的变化；采用基因芯片观察了有剂量依赖性变化的差异基因；并对部分基因进行了RT-PCR技术验证，采用Rat Alzheimer’s Disease PCR Array对基因芯片所筛选的信号通路进行了研究；采用了蛋白质质谱技术筛选检测了各组间有差异表达的蛋白质靶点。结果：黑逍遥散对Aβ25-35诱导AD 模型大鼠学习记忆能力具有改善作用；还可提高大鼠血清和脑组织中SOD与GSH-PX活性、降低MDA含量；可提高脑组织匀浆ChAT含量，降低AchE、MAO活性；可改善AD 模型大鼠脑组织病理损伤；基因芯片结果显示：与假手术组比较，模型组有583个基因上调表达，579个基因下调表达；与模型组比较，黑逍遥散各组干预AD大鼠模型后，71个基因的剂量依赖性上调，70个基因的剂量依赖性下调。RT-PCR技术对差异基因wisp1、crbbp、egr4、igfbp-1、casq2、Bcl-2、zfp483、zfp37和ZIC4进行了验证，结果显示RT-PCR与基因芯片结果一致。PCR Array结果显示：各剂量黑逍遥散干预后，6个基因Apbb1、map、AchE、casp3、clu、Apba1的表达出现了显著的变化。蛋白质谱芯片检测显示：与假手术组相比，模型组大鼠海马组织有50个蛋白上调，24个蛋白下调；与模型组相比，黑逍遥散高剂量组大鼠海马组织有46个蛋白上调，27个蛋白下调表达。结论：黑逍遥散对AD 模型大鼠学习记忆能力和脑组织病理损伤具有明显改善作用，其作用机制可能与抗自由基氧化、调节中枢胆碱能神经元和单胺类神经元活性有关。通过芯片筛选和验证了15个与AD相关的靶点，项目系统地研究了黑逍遥散的药理作用和靶点。