缺氧上调XBP1诱导LncRNA-565686表达促进VHL-mut肾细胞癌血管新生的作用与机制研究

Studies showed that hypoxia could promote angiogenesis, proliferation and migration of VHL mutant renal cell carcinoma, but the mechanism is not clear. In the preliminary study, we used hypoxic cells chip to select out LncRNA-ENST00000565686. Meanwhile, Mass Spectrometry and RNA pull down experiments showed that LncRNA-565686 could combine HIF-2α. At the same time, we found that LncRNA-565686 could sponge miR-646. Furthermore, knocking-down XBP1 could suppress LncRNA-565686 expression under hypoxia. Therefore, we raised up a hypothesis that hypoxia inducing XBP1 promoted LncRNA-565686 expression modulating HIF-2α and miR-646 signaling pathway to promote renal cancer angiogenesis, proliferation and migration hypothesis. To confirm the hypothesis, we will further clarify LncRNA-565686 and HIF-2α as long as miR-646 specific binding sites. Then we will demonstrate LncRNA-565686 regulated HIF-2α and miR-646 signaling pathways and phenotype of renal cell carcinoma. And we will prove hypoxia promoted LncRNA-565686 expression by inducing XBP1. This study will originally reveal a new mechanism of hypoxia-induced renal cell carcinoma progression and development, and also provide a new target for the treatment of renal cell carcinoma.

研究表明缺氧促进VHL突变型肾癌的血管生成、增殖和迁移，但具体机制尚不明确。前期研究中，我们通过缺氧细胞芯片筛选出LncRNA-565686，质谱及RNA pull down实验证明该LncRNA结合HIF-2α。同时，我们发现该LncRNA结合miR-646。此外，缺氧下沉默XBP1抑制该LncRNA表达。因此我们提出：缺氧通过上调XBP1诱导LncRNA-565686表达调控HIF-2α及miR-646信号通路促进肾癌细胞血管生成、增殖和迁移的假说。我们将进一步明确LncRNA-565686与HIF-2α和miR-646特异性结合位点；论证LncRNA-565686调控HIF-2α及miR-646信号通路影响肾癌的生物学行为。明确缺氧上调XBP1诱导LncRNA-565686的机制。本课题将从LncRNA角度揭示缺氧诱导肾癌发生发展的新机制，为肾癌的治疗提供新的靶点。

正常情况下，组织内氧供能够满足细胞代谢的需要，而在肿瘤组织内，肿瘤细胞过快生长，因此造成氧供往往低于细胞生长代谢的需要,从而产生缺氧(Hypoxia)。在缺氧状态下，缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor,HIF) 扮演着重要角色。研究表明缺氧促进VHL突变型肾癌的血管生成、增殖和迁移，但在 VHL-mut 肾细胞癌中，缺氧如何激活 HIF-2α 诱导肾癌发生的具体机制不明。 前期研究中，我们通过缺氧细胞芯片筛选出LncRNA-565686，质谱及RNA pull down实验证明该LncR NA结合HIF-2α。同时,我们发现该LncRNA结合miR-646。此外，缺氧下沉默XBP1抑制该LncRNA 表达。本课题首先通过构建慢病毒介导的 LncRNA-565686 沉默载体及过表达细胞株，利用 RNA-结合蛋白免疫共沉淀、RNA pull down和缺失作图法检测LncRNA-565686 与 HIF-2α 蛋白间是否存在特异性结合。利用生物信息学软件预测 LncRNA-565686 和 miR-646 特异性结合位点或区域,并验证 LncRNA-565686 调控 miR-646 下游基因信号通路相关蛋白变化。同时研究研究 LncRNA-565686 竞争性结合内源性 miR-646。研究缺氧促进LncRNA-565686表达活化HIF-2α及其下游基因信号信号通 路和竞争性抑制 miRNA-646 激活其下游基因信号通路的分子机制。结果发现，缺氧通过上调 XBP1 诱导 LncRNA-565686 表达水平升高,一方面通过结合 HIF-2α 蛋白调控下游 靶基因的表达,促进肾癌细胞的增殖和血管生成;另一方面,作为 ceRNA 结合并抑制 miR-646 表达,进而激活 NOB1→MAPK 信号通路,促进肾癌 细胞的增殖和迁移。本课题将从LncRNA角度揭示缺氧诱导肾癌发生发展的新机制，为肾癌的治疗提供新的靶点。