JNK通路抑制剂SP600125预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用和机制研究

Ischemia Pre-Conditioning (IPC) is a vital innate protective mechanism during kidney ischemia-reperfusion injury (IR). Previous study demonstrated the protective effects of JNK-specific inhibitor SP600125 in rat IR injury by anti-apoptosis and anti-inflammation roles. And we supposed that SP600125 may induce renal innate cells IPC cytoprotection via induction of autophage. In the current study, we investigate IPC process in etiology of IR injury and related discipline via isolated-perfused rat kidney model, and we emphasized on autophage and mitochondrial injury and apoptosis. We further assess the SP600125 signal-magnifying cascade by modulating mitochondrial permeability transition pore and autophage-intervene approach. In addition, we isolate renal tubular epithelial cells and cyto-mitochondrial to clarify the accurate effecter target of SP600125. Our finding may shed a new light for JNK pathway inhibition in renal IPC protection on both organ and cellular/sub-cellular levels, and may indicate novel therapy for renal ischemic injury.

缺血预处理(IPC)是器官保护重要的内源性机制。前期研究发现在肾脏缺血损伤中以JNK通路特异性抑制剂SP600125预处理，可通过抗凋亡、抑制炎症等机制发挥肾保护作用；JNK通路是介导大鼠IPC肾脏保护的重要信号通路。据此，我们推测"SP600125可能通过诱导自噬恢复肾固有细胞IPC保护作用"。本课题通过离体灌注模型探讨IPC对肾IR损伤的病理生理影响和规律，重点关注其对自噬、线粒体损伤及凋亡的影响。再给予调控自噬和mPTP开放干预，拟证明SP600125发挥作用依赖的信号级联；进一步应用分离的肾小管上皮细胞及线粒体确定SP600125的效应靶点。本课题首次在器官、细胞及分子水平上探讨JNK通路、细胞自噬在肾脏IPC保护中的作用及机制，为肾脏IR损伤的防治提供新思路。

缺血预处理(IPC)是器官保护重要的内源性机制。由于肾固有细胞自噬能力低下，线粒体功能减退(mtDNA 损伤)、氧化应激增强，同时肌酐清除率降低导致的内源性保护物质合成减少及IR 损伤中重要蛋白质(膜受体、下游的激酶、磷酸酶、促炎症因子等)的表达/活性的变化，总体导致肾对缺血预处理的敏感性减弱或消失。因此，迫切需要有效的改善肾脏对缺血预处理的敏感性，提高肾组织抗缺血损伤的能力。既往研究发现在肾脏缺血损伤中以 JNK 通路特异性抑制剂 SP600125 预处理可通过抗凋亡、抑制炎症等机制发挥肾保护作用；JNK 通路是介导大鼠 IPC 肾脏保护的重要信号通路。本课题通过离体灌注模型探讨 IPC 对肾 IR 损伤的病理生理影响和规律，分析其对自噬、线粒体损伤及凋亡的影响。再给予调控自噬和 mPTP开放干预，检测 SP600125 发挥作用依赖的信号级联；进一步应用分离的肾小管上皮细胞及线粒体确定 SP600125 的效应靶点。结果发现，SP600125 外源性阻断 JNK 通路可以恢复肾脏细胞对 IPC 保护作用的敏感性；在缺血损伤各组，细胞内钙离子水平均增高，给予SP600125处理的，细胞内钙离子水平低于未给药处理的（P<0.05）；在缺血损伤各组，细胞内ROS堆积明显，而给予SP600125处理的，细胞内ROS水平低于未给药处理（P<0.05）;通过观察RTEC细胞双层膜的自噬体统计发现，SP600125组自噬体数量相对对照组显著提高（P<0.05）; 细胞自噬抑制剂（3-Methyladenine,3-MA,3-甲基腺嘌呤）， MPTP 开放剂 （Atractyloside,Atr），和自噬基因沉默组干预后实验组自噬体的数量比对照组明显减少（P<0.05）；分离大鼠肾脏细胞、分离肾脏上皮细胞线粒体对线粒体功能，细胞凋亡等评估，结果发现了SP600125可以有效的保护线粒体功能，抑制细胞凋亡，通过保护线粒体/抑制氧化应激/抗凋亡通路恢复肾脏对IPC敏感性。以上问题的解决能验证了我们提出的“特异性阻断 JNK 通路能提高缺血性肾损伤对 IPC 刺激的敏感性、JNK 通路是介导肾脏缺血/再灌注损伤防治的重要靶点”的假说。本课题的完成，为肾脏缺血/再灌注损伤的防治提供一种新思路、新靶点和新的技术平台；具有重要的理论意义和应用价值。