环腺苷酸(cAMP)信号通路调控拮抗酵母细胞生活力的机理解析

Yeast has been selected as an effective biocontrol agent for postharvested fruits due to its ability to compete for nutrients with pathogens in wound of fruits. However, the main obstacle preventing yeast from the practical biocontrol application is viability loss of the formulated product. Based on our previous study that cyclic AMP (cAMP) prevented sodium citrate induced viability loss of biocontrol yeast Crypococcus laurentii, we hypothesize that the cAMP signaling pathway is involved in the lifespan regulation of yeast. The overall aim of the proposal is to test the above hypothesis. The specific aims include: 1) to establish the cell proliferation/death model under the key nutrient of sodium citrate, 2) to characterize the relationship between the yeast lifespan and cAMP level, 3) to study the impact of yeast phosphodiesterase inhibitors on the cAMP level and yeast lifespan, 4) to determine whether PKA and Ca2+ signalling pathway responds to the cAMP action in the presence of PKA-specific inhibitors, the Ca2+ chelator ,and Ca2+ release channel of IP3 receptor inhibitors. The studies on the regulation of the yeast lifespan by the cAMP signaling pathway in this proposal will provide insight into the production of liquid shelf-stable formulated biocontrol yeast.

利用拮抗酵母菌通过与病原菌进行营养与空间竞争来防治果实采后病害，是一种安全高效的水果保鲜新技术，但由于生活力丧失而导致生防效果与菌剂制品不稳定是制约其产业化应用的瓶颈。本项目基于前期研究中发现的添加外源环腺苷酸（cAMP）可延缓柠檬酸诱导罗伦隐球酵母细胞凋亡的现象，从探讨影响拮抗酵母细胞增殖/死亡的关键因子入手，确定cAMP调控拮抗酵母菌生活力的有效浓度；在对环腺苷酸磷酸二酯酶（PDE）基因克隆、表达、分离纯化可溶性蛋白的基础上，筛选并考察PDE抑制剂对酵母细胞生活力的影响以及PDE水解cAMP的机制；通过比较蛋白激酶A(PKA)抑制剂、Ca2+螯合剂、IP3配体门控Ca2+通道抑制剂对cAMP调控酵母细胞生活力的影响，揭示cAMP对PKA 或/和Ca2+通路的调控机制。本项目可望阐明cAMP信号通路调控罗伦隐球酵母细胞生活力的机理，为制备高效、低毒、低抗性的新型生物源防腐剂提供理论依据。

利用拮抗酵母菌通过与病原菌进行营养与空间竞争来防治果实采后病害，是一种安全高效的水果保鲜新技术，但由于生活力丧失而导致生防效果与菌剂制品不稳定是制约其产业化应用的瓶颈。本项目通过解决下面三个方面的科学问题，阐明了cAMP信号通路调控罗伦隐球酵母细胞生活力的机理：（1）柠檬酸钠对酵母细胞生活力的调控依赖于柠檬酸钠的浓度、酸度和离子组成，YNB能促进酵母细胞的大量生长，其中的氮源物质（硫酸铵和氨基酸）被优先利用进行代谢产能，而缺乏YNB会导致酵母细胞的大量死亡和碳源代谢指纹图谱的变化。通过用H2DCFDA标记活性氧的荧光显微镜和流式细胞仪的检测来研究细胞产生的活性氧变化情况，研究表明柠檬酸钠诱导的罗伦隐球酵母细胞生活丧失的过程中产生大量活性氧，而其生活力变化受cAMP途径的调控，L-Arg改善了柠檬酸钠诱导的酵母细胞生活力丧失，但是促进了酵母细胞活性氧的产生，L-Cit不仅促进了柠檬酸钠诱导的酵母细胞生活力的快速丧失，同时诱导其产生大量活性氧，SNAP对于由柠檬酸钠引起的细胞生活力变化的影响并不明显，PTIO能清除柠檬酸钠诱导酵母细胞产生的少量NO；（2）在对酵母Saccharomyces cerevisiae 环腺苷酸磷酸二酯酶1（PDE1）（1-369）基因克隆、表达、分离纯化可溶性蛋白的基础上，获得并解析出酵母环核苷酸磷酸二酯酶的晶体结构；并通过研究Native和Selenomethionyl两种条件下的蛋白在不同的金属离子（Mn2+，Mg2+，Zn2+等）存在下的酶活动力学参数KM，Kcat和Vmax，得到以cAMP为底物，不同金属离子缓冲液中PDE1（1-369）的KM值为100µM左右，kcat约为15s-1，而在以cGMP为底物时，KM和kcat值与cAMP为底物时差别不显著，说明金属离子对蛋白的影响比较小。此外 (kcat/KM)cAMP/(kcat/KM)cGMP在1～2之间，表明PDE1是一种典型具有双底物特性的水解酶。（3）通过比较转录组学解析了柠檬酸对调控酵母细胞cAMP信号通路、cGMP信号通路以及对Ca2+通路的调控机制。本项目的研究成果通过阐明cAMP信号通路调控罗伦隐球酵母细胞生活力的机理，为制备高效、低 毒、低抗性的新型生物防治菌的商业化产业化应用提供了理论依据。