柠檬酸对罗伦隐球酵母细胞生活力丧失机理的研究

拮抗酵母菌主要通过在果蔬伤口处与病原菌进行营养与空间竞争来防治采后病害，其产业化的关键在于最大限度保持菌剂的生活力。本项目针对前期研究中发现柠檬酸可诱导罗伦隐球酵母细胞生活力丧失的现象，拟从逆向思维的角度出发，在利用荧光标记技术明确柠檬酸诱导罗伦隐球酵母细胞死亡类型的基础上，采用代谢组学技术确定柠檬酸诱导罗伦隐球酵母生活力丧失过程中胞内代谢指纹与胞外代谢足迹图谱，并利用表型芯片技术分析柠檬酸对酵母细胞的碳、氮、磷、硫的代谢、小分子与大分子生物合成的影响，对酵母耐受外界渗透压、离子强度与酸度的影响，以及对细胞表面结构与运转功能、细胞呼吸、细胞应力和修复功能的影响，确定柠檬酸所诱导的罗伦隐球酵母细胞表型指纹图谱。通过特征代谢产物指纹/足迹图谱与细胞表型指纹图谱的相互印证，以阐明柠檬酸诱导罗伦隐球酵母细胞生活力丧失的机理，为筛选拮抗酵母菌生活力的保护剂提供新的思路和理论依据。

拮抗酵母菌主要通过在果蔬伤口处与病原菌进行营养与空间竞争来防治采后病害，其产业化的关键在于最大限度保持菌剂的生活力。本项目针对前期研究中发现柠檬酸可诱导罗伦隐球酵母细胞生活力丧失的现象，从逆向思维的角度出发，解决三个关键科学问题，阐明了柠檬酸诱导罗伦隐球酵母细胞生活力丧失的机理：（1）确定柠檬酸诱导罗伦隐球酵母生活力丧失过程中存在细胞凋亡，即细胞主动死亡的现象。利用磷脂结合蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）荧光探针检测，确定柠檬酸钠诱导拮抗酵母菌C. laurentii生活力丧失过程中，存在位于质膜内侧小页的磷脂酰丝氨酸迁移至质膜外侧小页的现象；利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL），确定拮抗酵母菌C. laurentii细胞因凋亡而出现了染色质凝集、片段化。在确定柠檬酸钠诱导C. laurentii细胞凋亡具有菌株特异性的基础上，进一步利用表型芯片技术确定C. laurentii细胞凋亡现象的产生与其碳源代谢指纹图谱存在一定的相关性。（2）揭示柠檬酸诱导罗伦隐球酵母细胞生活力丧失的特征代谢物质及其生物学意义。通过比较不同色谱柱对37种脂肪酸的分离性能构建检测脂肪酸的方法，并解析了罗伦隐球酵母细胞内脂肪酸指纹图谱的变化规律。利用激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞术，发现在柠檬酸钠诱导拮抗酵母细胞生活力快速丧失过程中活性氧（ROS）产生高峰远早于酵母细胞凋亡早期特征的发生高峰，添加外源GSH确定ROS在调控酵母细胞凋亡中发挥重要作用。通过GC-MS进行胞外代谢产物的测定以及构建的拟稳态模型，发现柠檬酸钠仅作为外源诱导因素来影响整体代谢网络的通量水平。（3）确定柠檬酸作为外源信号分子发挥作用并解析其生物学意义。利用表型芯片技术进一步揭示影响柠檬酸钠对C. laurentii生活力影响的促进/拮抗营养因子，确定柠檬酸钠作为外源信号调控罗伦隐球酵母细胞生活力，受柠檬酸钠的浓度、酸度、离子组成和YNB中的营养因子。利用代谢组学手段解析果实采后衰老期间糖、酸、氨基酸等非挥发性风味物质的变化规律，利用表型芯片技术解析李果实采后病原菌的生物学特征，尤其是碳源代谢指纹图谱的菌株特异性，阐明拮抗酵母菌-病原菌-果实之间互作的物质基础。本研究阐明了柠檬酸诱导罗伦隐球酵母细胞生活力丧失的机理，为筛选拮抗酵母菌生活力的保护剂提供新的思路和理论依据。