双链RNA病毒甲基转移酶活性位点的空间定位--冷冻电镜原子分辨三维重构

RNA capping of dsRNA viruses is an important biochemical process following mRNA transcription. The cap structure plays roles in protecting mRNA from degradation and ensuring efficient viral protein translation. Capsid proteins of the dsRNA viruses contain two methyltransferases that are necessary for the capping. Localization of the two methyltransferase active sites is of important significance to elucidate the biochemical mechanism for RNA capping, and to design anti-viral drugs. Cryo-electron microscopy (cryo-EM) does not need crystallization and keep the native state of biological macromolecules. Therefore, it is an ideal method for three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules including viruses. The goals of this project proposal are to determine the 3D structure of a dsRNA virus undergoing RNA capping process at an atomic resolution (~3.0 angstrom), to localize the active sites of the viral methyltransferases and understand the property of adjacent amino acid residues, and to elucidate structural mechanism for dsRNA virus RNA capping. Viruses in the family Reoviridaeare used as a model system here. In addition, data processing algorithms of 3D reconstruction and softwares will be improved in order to push the reconstruction resolution. Therefore, the goal of the project proposal also includes an important technical innovation of high-resolution 3D reconstruction of viruses.

双链RNA病毒的RNA加帽过程是伴随mRNA转录的一个重要生化过程。其帽子具有防止RNA降解和确保病毒蛋白高效翻译的功能。双链RNA病毒的衣壳蛋白包含加帽所需要的两个甲基转移酶，其活性位点的空间定位对于揭示RNA加帽的生化机制和设计抗病毒药物有着非常重要的意义。冷冻电镜生物大分子三维重构方法不需要样品结晶，生物大分子保持了其生理状态，是研究病毒等生物大分子复合物的理想方法。本项目拟用呼肠孤病毒为模式生物，应用冷冻电镜三维重构方法测定处于加帽过程中的病毒原子分辨率（～3.0埃）三维结构，从而精确测定其处于加帽反应过程中的病毒甲基转移酶活性位点的空间位置及其周边氨基酸残基的属性，阐明RNA加帽的结构机制。同时，本项目拟通过改进重构数据处理的算法和软件来推进重构分辨率，因此也是一个冷冻电镜高分辨率三维重构技术革新上的重要攻关课题。

随着电子显微技术的发展、电子直接探测相机发明及计算计算能力的增强，冷冻电镜单颗粒技术已成为结构生物学的最有力工具。对于分子量巨大的病毒结构解析来说，冷冻电镜几乎成了唯一工具。本项目旨在利用冷冻电镜单颗粒技术解析转录态质型多角体病毒衣壳的近原子分辨三维结构，进而确定其甲基转移酶活性位点的空间位置，从而阐明双链RNA病毒转录的加冒过程；同时，发展冷冻电镜三维重构的方法与软件，解决高分辨重构的瓶颈问题。在本项目的资助下，我们取得了如下主要成果：.1）提出了一种冷冻电镜二十面体病毒对称失配三维重构的全新方法，利用该方法，病毒结构研究近50年来，首次求解了多角体病毒在转录和非转录两种状态下内部基因组及RNA聚合酶的三维结构，揭示了不同状态下衣壳内部RNA聚合酶及其与双链RNA相互作用的精细构象变化，提出了双链RNA病毒在复制和转录过程中RNA聚合酶的构象变化及其与RNA协调工作模型。相关成果发表于Science (2015, 349: 1347)。 .2）利用冷冻电镜单颗粒技术，求解了转录态多角体病毒衣壳3.8Å分辨的三维结构。三维结构清楚地展示出了小分子SAM/SAH的密度，从而精确确定了两个甲基转移酶活性位点的空间位置。相关成果发表于J Mol Biol (2014, 426: 2167)。.3）优化了冷冻电镜数据处理的算法与软件，利用200kV的冷冻电镜，我们获得质型多角体病毒衣壳3.3Å分辨和衣壳内部对称失配的聚合酶3.9Å分辨的三维结构，其分辨率完全能与300kV电镜的结构相当，基于重构密度图能准确地构建相应的原子结构模型，相关成果发表于Biophysics Report (2016, 2: 25-32)和J Mol Biol (2017, 429: 79-87)。