一株真菌Bipolaris sorokiniana 11134中双功能萜类合酶催化的新颖萜类化合物挖掘和酶的功能解析

Terpenoids from fungi remain a rich source of novel compounds for drug leads contributing immensely to the development of many products for diverse indications. The key scientific question of our project is how to target novel terpenoid synthases and novel terpenoids with significant mechnism. This proposal describes a research strategy combined genome mining, molecular biology and natural product chemistry to investigate novel active drug leads from Bipolaris sorokiniana 11134. Based on a systematic bioinformatics analysis of fungal genomics database, a known bifunctional terpene synthase (BF-TPS) is used to fish its homologous sequences, and subsequently, targeted biosynthetic gene clusters (BGCs) will be activated by heterologous expression method. The MS/MS networking and LC-MS guided identification of terpenes will be performed for isolation of targeted compounds. The application of multidisciplinary fields will provide an efficient approach to excavate drug leads with new mechnisms.

真菌萜类化合物具有复杂独特的结构和广泛的生物活性，一直是药物先导化合物的重要来源，本项目围绕“如何快速发现新颖萜酶基因并获得具有新颖结构/新生物合成机制的萜类化合物”这一科学问题，基于实验室已经构建的多种生态环境的真菌，以功能独特且研究较少的双功能萜酶作为“探针”，通过生物信息学分析优选出新颖双功能萜酶的菌株；利用异源表达激活双功能萜酶基因簇；并依托先进的小分子二级质谱网络平台和LC-MS手段，从一株真菌Bipolaris sorokiniana 11134中快速靶向追踪分离新颖目标萜类化合物，并对其生物合成机制进行初步解析。本项目研究对挖掘具有潜在新颖作用机制的药物先导化合物具有重要意义。

本项目基于多学科交叉技术，从实验室自建的1000多株植物互生真菌基因组数据库中，以双功能萜类合酶（BF-TPS）为“探针”，成功筛选到潜力菌株Bipolaris sorokiniana 11134中的具有新颖催化机制的双功能萜类合酶BsPS，结合异源表达及前期实验室建立的小分子化合物快速排重平台（MS/MS networking）分离鉴定新颖萜类化合物，共获得6个二倍半萜类化合物，其中2个为新化合物。化合物Fusaproliferin和Sestersorokinicin A具有中等抗炎活性，10 μM浓度时的NO抑制率分别为36.6 ± 2.4% and 24.9 ± 2.1%。基于体外生化反应，初步推测了这些二倍半萜化合物的生物合成机制。更进一步，通过蛋白质工程和分子动力学方法对BsPS的催化机理进行初步解析。基于半理性设计的蛋白质工程改造策略定位到BsPS的功能位点，该位点通过与催化口袋内芳香族氨基酸的相互作用，间接影响碳正离子的迁移路径，催化产生新的具有丰富骨架的萜类产物。这种半理性改造双功能萜类合酶的策略和类似于“多米诺效应”的催化机制对后续萜类合酶的蛋白质工程改造以及深入的催化机制研究具有借鉴意义。.另外，依托该项目，我们从该潜力菌株中我们还发现可催化产生新颖倍半萜化合物的倍半萜合酶BsSQS8。通过米曲霉异源表达系统对BsSQS8进行单基因功能表征和与后修饰酶P450串联表达，基于实验室前期构建的MS/MS分子网络FBMN（Feature-Based Molecular network），成功获得26个sativene类衍生物，其中7个为新颖桥环化合物，命名为Biposoropenoid A−G。.上述研究工作共发表SCI论文17篇，申请专利5件，授权2件。本项目的研究工作拓展了真菌萜类天然产物库，为有机合成及药物先导化合物研究奠定了物质基础；发现了具有新颖催化机制的萜类双功能萜合酶BsPS，初步揭示了其催化机制，为新颖天然产物的生物合成提供基因元件，也为基于基因组挖掘的新颖天然产物高效发现及新颖酶的催化功能解析提供了借鉴和思路，具有重要的研究意义。