谷氨酸在糖尿病大鼠外周痛敏化中的作用及其机制研究

Diabetic hyperalgesia is one of the chronic complications that influence the quality of life. It is a problem in clinical treatment for diabetes because the mechanism underlying the hyperalgesia is not clear. Based on previous study, we put forward that there exist independent peripheral process in secondary hyperalgesia, and some neurotransmitters and their receptors especially glutamate may play an important role by non-synaptic transmission. The double guides of record from single nerve filament will be used in the present study to investigate the secondary hyperalgesia induced by antidromic electrical stimulation and the effect of glutamate release, absorption, receptors, PKA and PKC in diabetic Dark-Agouti (DA) rats. Meanwhile, whole cell patch clamp method will be used to record the spontaneous and/or induced discharge, NMDA and AMPA currents and the effect of PKA and PKC in diabetic DA rats in dorsal root ganglion (DRG). In addition, immunofluorescence approach and western blotting methods will be used to observe the expression of glutamate receptor and transporter in spinal cord and DRG following hyperalgesia in diabetic DA rats. The purpose of the present study is to illustrate the peripheral effect and mechanism of glutamate on hyperalgesia in diabetic rats, and to provide strategy and experimental basis for development of new analgesics targeted on peripheral sensory nerves.

糖尿病痛敏化是影响患者生活质量的常见慢性并发症，因机制尚不清楚，使其难以有效防治。以往的研究认为，痛敏化存在着独立的外周过程，多种感觉神经递质及其受体，尤其是谷氨酸可能通过非突触性传递起重要作用。本研究拟在糖尿病的Dark-Agouti（DA）大鼠上，采用行为学方法观察其痛敏化，同时采用双导单纤维记录的方法，以外周感觉神经的活动作为痛敏化的指标，观察谷氨酸离子型受体、PKA和PKC在其中的作用。采用全细胞膜片钳方法，记录糖尿病大鼠背根节中小神经元的电学特性、NMDA和AMPA通道电流变化，并观察PKA和PKC抑制剂对其的影响。用免疫荧光双标和Western法，观察痛敏化时脊髓和背根节中谷氨酸受体和转运体的表达和含量变化，以及PKA和PKC在其中的作用。通过上述研究，以期阐明谷氨酸在糖尿病大鼠外周痛敏化过程中的作用和机制，并为以外周谷氨酸受体为靶点的新型镇痛药的开发提供实验依据。

糖尿病周围神经病变是糖尿病的三大并发症之一，严重影响患者的生活质量，但是因其目前机制不清，也是临床治疗的难题之一。本研究在链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射（1%，70 mg/kg）所致的糖尿病大鼠模型上，采用行为学方法、电生理学记录和免疫组化法，并结合NMDA受体拮抗剂MK-801注射，观察糖尿病大鼠的痛敏化行为，背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）中小神经元钙电流的变化，背根神经传入放电，L4/L5脊髓节段DRG和脊髓背角pCREB 和磷酸化的NMDAR1的表达，并分析NMDA受体在其中的作用。结果发现，STZ注射后3天即可引起大鼠空腹血糖显著升高，并持续8周。注射STZ后2-3周，部分大鼠开始出现机械痛敏化（38.78%），但是也有部分大鼠未出现机械痛敏（61.22%）；所有大鼠均未出现热痛敏行为。选择造模成功的大鼠，于腹腔注射STZ后1周腹腔注射MK-801（1mg/kg，1次/天，连续6天），80.00%的大鼠未出现机械痛敏化；出现机械痛敏化的大鼠在注射STZ后4周足底微量注射MK-801（1mM，50μL）也可以显著减轻大鼠的机械痛敏。电生理学结果显示，腹腔注射STZ后21-28天的糖尿病大鼠DRG中小神经元高电压门控（high voltage gated，HVA）钙离子通道电流和低电压门控（low voltage gated，LVA）钙离子通道电流显著增加；MK-801（0.1 mM，10μL）可以翻转上述过程。另外，糖尿病大鼠初级传入神经的机械阈值下降、自发放电增加和传导速度下降，谷氨酸NMDA受体拮抗剂可增加机械阈值和减少传入放电。形态学结果显示，糖尿病大鼠从造模后3天即出现DRG和脊髓背角pCREB表达的增加，可以持续8周；而脊髓背角磷酸化的NMDAR1表达增加主要出现在注射STZ后第8周。MK-801连续注射（1mg/kg，1次/天，连续6天）可以减少脊髓背角pCREB和磷酸化的NMDAR1的表达。上述研究提示，部分糖尿病大鼠会出现机械痛敏化行为，这可能与DRG中小神经元钙电流的变化和背根传入放电，以及DRG和脊髓背角中pCREB和NMDAR1表达增加有关，谷氨酸NMDA受体参与介导此过程。