RIZ1蛋白在恶性脑膜瘤增殖中的作用及机制研究

Proliferation dysregulation plays a critical role in the development and progression of malignant meningioma. Our previous study demonstrated that expression levels of RIZ1 were inversely associated with pathological grade of meningioma and forced expression of RIZ1 might inhibit proliferation of meningioma cells via G2/M arrest. However, the intrinsic molecular regulatory mechanism remains largely unclear. Moreover, we found thatforced expression of RIZ1 may downregulate expression levels of c-Myc and UbcH10 and thus activate G2/M checkpoint. Therefore, we speculate that RIZ1 may compromise the mitotic checkpoint function and promote cell proliferation via inducing UbcH10 expression in meningioma cells. In this study, firstly, the mechanisms of cell proliferation mediated by RIZ1 via inducing UbcH10 expression were investigated by using RNA interference and overexpression assay. Secondly, the regulatory mechanisms of UbcH10 biosynthesis mediated by RIZ1 were investigated by using luciferase reporter assay and ChIP assay. Finally, in vivo study and retrospective clinical study were employed to verify the regulatory mechanisms of RIZ1 on UbcH10 biosynthesis and the association with cell proliferaion. These results may demonstrate the mechanisms of cell proliferation mediated by RIZ1 via inducing UbcH10 expression and may offer potential therapeutic targets for the molecular intervention of malignant proliferation.

增殖失控是恶性脑膜瘤发生发展过程中的重要机制，前期研究发现RIZ1表达与脑膜瘤级别呈负相关，在恶性脑膜瘤细胞中过表达RIZ1可抑制细胞增殖并导致G2/M期阻滞，但其分子机制尚不明确。后进一步发现RIZ1与c-Myc、UbcH10呈关联表达，过表达RIZ1可下调c-Myc、UbcH10表达，并激活导致G2/M期阻滞。因此，我们推测RIZ1可能通过UbcH10等表达调控脑膜瘤恶性增殖。本课题拟应用RNA干扰、过表达等方法，研究RIZ1通过c-Myc、UbcH10调控脑膜瘤细胞增殖的分子机制；然后通过荧光素酶活性检测联合ChIP实验，探讨RIZ1对UbcH10的转录调控作用；最后通过体内试验和临床标本分析验证RIZ1对c-Myc、UbcH10的调控及其与脑膜瘤恶性增殖的关联。研究结果有望阐明RIZ1通过UbcH10调控脑膜瘤增殖的机制，并可能为恶性脑膜瘤增殖失控的分子干预提供潜在靶点。

增殖失控是恶性脑膜瘤发生发展过程中的重要机制，前期研究发现RIZ1表达与脑膜瘤级别呈负相关，在恶性脑膜瘤细胞中过表达RIZ1可抑制细胞增殖并导致G2/M期阻滞，但其分子机制尚不明确。我们通过原代细胞培养构建了不同级别的脑膜瘤原代细胞系，提供实验载体。接着，我们构建并纯化了可转导的PR domain蛋白，PR domain为RIZ1主要功能区，在体外和体内实验中发现该蛋白对于高级别脑膜瘤具有明显的肿瘤抑制作用，另外，我们发现PR domain能够通过甲基转移酶活性甲基化组蛋白H3的第九位赖氨酸（H3K9），调节下游c-Myc的表达。在52例脑膜瘤固定标本中行免疫组织化学分析RIZ1和UbcH10的表达情况发现两者表达呈明显的负相关。此后，构建针对UbcH10的siRNA，分析其在恶性脑膜瘤细胞中的生物学功能，发现UbcH10-siRNA可显著抑制细胞增殖、迁移、侵袭并促进凋亡。最后通过染色质免疫共沉淀技术明确了c-Myc同UbcH10启动子区域有直接结合，且有2个固定的结合位点，分别位于分别位 于 -1329/-1324bp和-212/-207bp的E-box区域（5’-CACGTG-3’）。通过双荧光素酶报告基因技术、慢病毒转染技术验证了RIZ1 对 UbcH10 的作用依赖于其负向调控c-Myc而产生。本研究较系统地研究了RIZ1与 c-Myc、UbcH10的作用关系及其在脑膜瘤细胞有丝分裂检验点调控机制中的作用，为阐明其促进脑膜瘤细胞恶性增殖的分子机制提供实验依据，国内外尚无类似研究，可能为临床上提供潜在的分子靶标并为恶性脑膜瘤的分子干预提供初步实验依据。