囊泡栓系因子Sec3协同Rho1识别t-SNARE的机制研究

Vesicle trafficking plays an important role in the physiology of cells, mediated by budding, transport, tethering and fusion. SNARE is a key complex during membrane fusion, the defects of which are closely related to a series of neurological and immunological diseases, diabetes, etc. Given its importance, its discovery won the 2013 Nobel Prize in Physiology. The preliminary work of the applicant showed the tether Sec3 can directly interact with the t-SNARE protein Sso2 by changing its ‘closed’ autoinhibitory conformation to an open state, facilitating the assembly of the binary t-SNARE complex. However, it is still unclear how Rho1 collaborating with Sec3 regulates the assembly of SNARE. This study aims to understand the recognition mechanism of Rho1-Sec3-Sso2. Firstly, we will purify Rho1, Sec3 and truncated Sso2. Secondly, we will reconstitute the Rho1-Sec3 dimer, analyzing its binding to the different Sso2 truncations. After the evaluation of Rho1-Sec3-Sso2 in high quality, we will select the trimer for the crystal screening. This project focuses on the regulation of the SNARE assembly, aiming to provide new evidence to know how tethers and SNARE work together to promote membrane fusion.

囊泡运输是细胞行使生理功能的重要机制，主要经历了出芽、传输、栓系和融合四个环节。SNARE是膜融合环节的关键复合体，其组装的缺陷与一系列神经和免疫学疾病、糖尿病等密切相关，SNARE的发现也因其重要性获得了2013年的诺贝尔生理医学奖。申请者前期工作表明栓系因子Sec3参与识别t-SNARE蛋白Sso2，使其从自抑制的闭合状态转变为开启状态，有利于t-SNARE蛋白二聚体的组装。然而对于Rho家族蛋白如何协同Sec3调控SNARE组装依然不清楚。本研究将详细刻画Rho1-Sec3-Sso2的分子识别模式，首先纯化Rho1，Sec3及不同截短的Sso2，接着重组Rho1-Sec3二聚体，系统分析Rho1-Sec3与不同截短Sso2的亲和力，确立优势重组单元，并尝试对其进行晶体进行初筛。该项目将探索SNARE的调控组装机制，为了解栓系因子如何协同SNARE促进膜融合提供新的实验依据。

囊泡栓系因子Sec3是膜栓系过程中的核心蛋白，其参与栓系八聚体的形成，通过牵拉囊泡锚定到细胞质膜，是细胞胞吐过程的标志性事件。本研究围绕栓系因子Sec3在胞吐过程的生物学功能这一主题，揭示了Sec3能够协同Rho1识别膜融合蛋白SNARE，阐明了Sec3质量控制因子在胞吐过程中的角色，特别是其对胞吐作用的主要场所花粉管的形态影响，以及早期胚胎发育的影响。我们发现质量控制因子的功能丢失会导致胚胎致死。此外，白化胚珠在早期胚胎发生过程中胚胎的形态形成是正常的，但是在后期阶段胚胎的生长被阻止了。种子发育在互补系中开始正常化，表明质量控制因子在胚胎发生过程中起着重要作用。同时，胚胎发育的缺陷会导致配子受精率降低，较小的花粉可以正常发芽，但花粉管的竞争力却大大减弱。雌配子体受到损害，也会导致花粉管的缺陷。为理解囊泡栓系在胞吐过程中所扮演的角色提供理论依据。本研究还以胞外囊泡分泌的肠道益生菌为研究对象，筛选了2200万个小分子，首次鉴定出半乳糖苷肌醇能够显著识别通道蛋白。进一步对该新型益生元与受体的结合进行实验验证。先对受体蛋白寡聚状态进行精细分离，经分子排阻色谱分离的蛋白呈两个显著峰值，分别代表该蛋白的二聚体和单体状态。通过等温滴定量热法揭示了受体能够以纳摩尔级的强结合力识别半乳糖醇。我们鉴定了受体蛋白上的10个核心氨基酸与半乳糖醇形成显著的氢键相互作用。通过微秒尺度的分子动力学模拟发现，半乳糖苷肌醇能够在受体口袋中形成多样化的结合模式，通过六个显著的自由能态参与识别过程。这有助于增殖益生菌从而分泌胞外囊泡，调节免疫作用增进肠道微生态健康。