Exocyst复合体中Sec3识别和结合其他亚基的分子机制

The exocyst complex is a highly-conserved octameric complex implicated in tethering the secretory vesicles to the plasma membrane in exocytosis. It is involved in a wide variety of cellular processes including cell polarity establishment, cell migration, cytokinesis, ciliogenesis, pathogen infection and tumor development. However, the mechanism of the exocyst complex assembly and function is largely unclear. Recently, the structure of the exocyst complex has been solved at near-atomic resolution, and the mechanism of exocyst assembly has been described at the protein domain level. Yet which amino acids are involved in the complex assembly is still unknown. This proposal is based on the exocyst structure, aiming to identify the key residues of Sec3 that play pivotal roles in recognizing and binding to other exocyst subunits. First, the interaction between the Sec3 CorEx motif and other exocyst subunits will be detected via mitochondria-targeting assay and Co-IP assay. Then, a series of mutations will be designed based on multiple sequence alignment of the Sec3 CorEx motif, and constructed to detect the interactions with other subunits. The key residues will be those lose binding after mutagenesis. After pinpointing the key residues of Sec3, mutant yeast strains will be made to verify their function by growth assay and secretion assay. The result of this research will shed light to the mechanism of exocyst assembly and function.

Exocyst是一个高度保守的八亚基复合体，介导细胞外分泌过程中囊泡到细胞膜的拴系过程，在多种细胞基本生命活动中起重要作用。然而，其组装和功能机制却并不清楚。最近，Exocyst近原子分辨率结构得以解析，阐述了其结构域水平的组装机制，但在氨基酸水平仍不清楚。本项目拟基于Exocyst结构信息，鉴定Sec3中识别和结合其他亚基的关键氨基酸位点。首先，检测Sec3 CorEx motif与其他Exocyst亚基的互作。然后，在Sec3 CorEx motif内设计系列点突变，并检测Sec3突变与其他亚基的互作，从而找到Sec3中识别和结合其他亚基的关键氨基酸位点。最后，构建突变酵母株，通过酵母的生长实验和细胞外分泌能力的检测，验证这些关键氨基酸位点的功能。本项目将首次从氨基酸水平揭示Sec3识别和结合其他Exocyst亚基的分子机制，为Exocyst进一步的组装机制和功能机制的研究提供基础。

Exocyst是一个保守的八亚基拴系复合体，调控细胞外分泌过程中分泌囊泡与细胞质膜的识别和锚定作用，在细胞极性的建立与维持、细胞生长和迁移、信号转导等众多生命过程中都起着重要作用。2018年,申请人解析了Exocyst近原子分辨率结构，发现其各亚基N端都有一个CorEx motif，并通过该motif形成四元亚复合体，最终组装成完整复合体。该工作从结构域水平揭示了Exocyst复合体的组装机制，然而更精确的氨基酸水平的机制仍不清楚。Exocyst由Sec3等八个不同的亚基组成，其中Sec3定位于细胞膜上，标示细胞外分泌位点并招募其他亚基到细胞膜。阐明Sec3识别和结合其他亚基的分子机制对于阐明Exocyst复合体的组装和功能机制具有十分重要的意义。.本项目的研究目标为解析Sec3识别和结合Exocyst复合体中其他亚基的分子机制，主要研究内容包括检测Sec3的关键结构域CorEx motif与其他Exocyst亚基的相互作用情况，寻找Sec3蛋白中结合其他Exocyst亚基的关键氨基酸，并研究 Exocyst的Sec5亚基中结合Sec3的关键氨基酸，最后分析Sec3的关键氨基酸突变是否会引起功能缺陷。.通过在Sec3 敲除的酵母菌株中构建线粒体定位系统，我们发现Sec3 CorEx motif能够将其他Exocyst亚基募集到线粒体上，通过Co-IP实验验证了Sec3 CorEx motif能够与其他Exocyst亚基相互作用。通过在Sec3 CorEx motif构建一系列点突变，我们发现其N端的两个疏水氨基酸突变后，Sec3 CorEx motif不再能够招募或结合其他亚基。并且，携带这两个氨基酸点突变的Sec3全长也不再能够招募或结合其他亚基，携带了该突变的酵母菌株在生长和外分泌过程中表现出严重缺陷，表明这两个氨基酸介导的疏水相互作用在Exocyst复合体的组装中发挥关键作用。此外，我们进一步研究了CATCHR拴系复合体家族的另一复合体GRAP，验证了其Vps52和Vps54亚基CorEx motif的功能，并鉴定了Vps54 CorEx motif中对于GARP复合体组装起关键作用的疏水氨基酸。这些结果表明了CorEx motif对于CATCHR拴系复合体组装的关键作用，并揭示了其中关键氨基酸介导的疏水相互作用在CATCHR拴系复合体组装中至关重要。