稻瘟病抗性蛋白（Pi-ta）与无毒蛋白（Avr-pita）细胞内可视化和分子识别机理研究

水稻和稻瘟病菌Magnaporthe oryzae是研究植物与微生物相互作用的模式系统。深入研究水稻抗性基因Pi-ta与稻瘟病原菌无毒基因Avr-pita的作用机理，具有理论和生产应用上的意义。本课题开展以下几个方面研究：（1）应用荧光标记展示寄主蛋白Avr-pita和宿主蛋白Pi-ta在宿主细胞内的动态识别过程；（2）利用双分子荧光互补系统（BiFC）揭示Pi-ta和Avr-pita蛋白复合体在宿主细胞内相互作用的场所和方式；（3）利用酵母双杂交寻找植物体内参与抗性反应且与Avr-pita相互作用的蛋白因子；（4）通过在宿主细胞内诱导型表达Avr-pita，揭示Pi-ta和Avr-pita识别和互作过程中各种与之相关的特异宿主基因的表达谱。（5）用反向遗传学方法进一步研究若干下游基因与抗性反应的关系。通过本研究，阐明无毒基因- - 抗性基因互作的分子机制及其抗病反应的基因调控网络。

该项目资助是本人2010年从海外留学回国创业后获得的第一项资助。对我个人成长和创业起步有着重要的作用。在过去3年中，通过国家基金委资助，研究主体内容得以基本完成，本人在课题相关研究领域发表SCI论文2篇，还有一篇较高质量和水平的SCI论文正准备发表。.在项目研究过程中，我们创造性建立了一种基于PCR的载体构建的方法，Omega-PCR。利用Omega-PCR方法，我们顺利的实现了不经过抽提mRNA和反转录直接从水稻基因组DNA中克隆获得Pita的全长cDNA，并完成相关转化载体的构建，极大地简化和缩短载体构建进程。为了推广这项技术，我们撰写该方法的研究论文并发表在著名学术期刊Plant & Cell Physiology（SCI影响因子为4.134），国家基金编号（31071646）为第一标注。.任务书中所涉及的研究目的基本达到，取得一系列实验结果，具体归纳如下：.1).构建载体转化水稻，获得Avrpi-ta的2个雌二醇诱导型转基因稳定转化系。.2).确定了诱导系的最佳诱导浓度和处理时间为5 µM 雌二醇6小时。.3).明确了无毒蛋白在水稻细胞中表达能被内源的抗性基因Pi-ta识别并激活抗病反应。在缺乏相应抗性基因Pi-ta的情况下，无毒蛋白会抑制植物的基础抗性。.4).通过对诱导系的两次芯片结果分析，我们确定了23个基因符合在TAP中上调，在SAP和KAP中下调的基因。并通过qRT-PCR确认了其中4个基因的表达模式。.5).免疫共沉淀实验经过摸索获得一些差异蛋白，差异蛋白的测序分析正在委托公司做最后的分析。.6). 通过荧光蛋白标记，对Pi-ta和AVR-Pita进行亚细胞定位。结果表明，两种蛋白定位于线粒体中。.7). 通过酵母双杂交筛选获得4个候选基因，结合亚细胞定位结果，着重研究COX11与Pita和AVR-Pita的关系。.出席国内学术会议3次，国际会议1次，相关研究成果在学术会议上与同行进行了汇报和交流。同时，还邀请了奈良先端科技大学河野洋治博士到华南农业大学讲学交流。.在人才培养方面，项目主持人2012年入选广东省“千百十工程”省级培养对象和教育部新世纪优秀人才支持计划。在项目实施过程中，本人指导了硕士研究生共5名，2名博士研究生，其中一名硕士生已顺利毕业。作为指导老师，指导大学生参加国际基因工程机器大赛（iGEM），荣获亚洲区金奖。.经费使用规范合