MALDI-TOF/TOF-MS解析动物药中标志蛋白质和多肽作为特征识别物的研究

Presently, authentication of animal-derived medicines is primarily based on the macro or micro external visual characteristics, small molecules or DNA, etc., and some undesired inherent limitations exist. In this proposal, MALDI-TOF/TOF-MS as the key technology, and two-dimension electrophoresis, two-dimension nanoflow liquid chromatography and de novo sequencing are incorporated for the elucidation of signature proteins and peptides in multi-source, complex, horns, animals crustaceans and glue-like animal-derived medicines with Bombyx Batryticatus, Cervi Cornu, Cervi Cornu Pantotrichum, Asini Corii Colla and Testudinis Carapax ET Plastrum as models. These identified proteins and peptides can be used as their specific markers, and the intrinsic unique peptide fragment in the markers would be the direct evidence for the authentication of these animal-derived medicines. The key technology established could be a new approach for the specific authentication of animal-derived medicines, with the intention to help ensure the quality, the safety and the effectiveness of the medicines in their raw material and ready-in-use form. At the same time, the study has an important academic significance to promote the seamless integration of proteomics, bioinformatics and Chinese medicine authentication.

动物药的鉴定目前主要依据宏观或微观的外在可视特征、小分子或DNA等，存在一些固有的局限性。本项研究以MALDI-TOF/TOF-MS为核心技术，并结合二维电泳、二维纳流液相色谱和肽序列从头测序算法等手段，选择僵蚕、鹿角、鹿茸、阿胶和龟甲为模型药物，解析多基源、复合体类、角类、动物甲壳类和胶类动物药药材与饮片中的标志蛋白质和多肽等，以作为它们的特征识别物，并以其含有的特异性多肽片段作为鉴定的直接依据。本项研究可为动物药的专属性鉴定构建一条新的研究途径，建立关键的技术，对确保动物类中药药材和饮片的质量，从而保证用药的安全性、有效性具有重大的应用价值；同时，本研究可促进蛋白质组学、生物信息学与中药鉴定的有机结合，有着重要的学术意义。

动物药的鉴定目前主要依据宏观或微观的外在可视特征、小分子或DNA等，存在一些固有的局限性。本研究以动物药僵蚕为模型药物，通过使用SDS-PAGE、二维电泳、MALDI-TOF/TOF-MS分析等，找到了其有别于家蚕、白僵菌的标志蛋白和多肽，并解析其氨基酸序列和特异性多肽片段。以临床常用的胶类动物药阿胶、鹿角胶、龟甲胶等为研究对象，通过使用特异性消化酶（胶原蛋白酶、胰蛋白酶等）酶解，并以高分辨生物质谱技术（基质辅助激光解吸附质谱、轨道离子阱质谱）进行分析，从而揭示了其相互区别的14个多肽片段。深入研究动物药僵蚕生品经过炮制后原有标志蛋白和多肽发生的变化，并以胰蛋白酶消化制备多肽片段混合物，反相HPLC纯化、制备多肽片段，最终以NanoLC-Orbitrap MSD技术确定了僵蚕生品与炮制品的特征识别物和特异性多肽片段。此外，还完成了僵蚕、胶类动物药（阿胶、鹿角胶、龟甲胶、鳖甲胶）、角类动物药（鹿角）、甲类动物药（龟甲、鳖甲）的蛋白质分析研究（含量测定、氨基酸组成），建立了相应的电泳分析方法。.本项研究为动物药的专属性鉴定构建一条新的研究途径，建立了关键的技术，对确保动物类中药药材和饮片的质量，从而保障用药的安全性、有效性具有重要的应用价值；同时，本研究促进了蛋白质组学、生物信息学与中药鉴定的有机结合。