基于酶催化过渡态理论研究结构脂合成中酰基迁移机制及影响氧化规律

Acyl migration，is the key side reaction occurred in enzyme-catylized synthesis, seriously affects the quality and oxidative stability of structural lipids. The transition state of the substrate is determined to understand and clarify the mechanisms of acyl migration in enzymatic transesterification. In this study, the lipase-catalyzed transesterification of 1,3-dioleyl-2- palmitoyl glycerol （OPO）was selected as reaction model, the mechanism of acyl migration and clarify the regulatory mechanism were studied through investigating the effects of reaction factors on the enzyme-substrate binding mode and structural changes. On the other hand, OPO, LPL, LnPLn and their acyl migration isomers (POO, PLL, PLnLn) are used as triacyglycerol models to study the mechanism of lipid oxidative stability affected by acyl migration. Considering the fatty acid double bond number,, location and esterificatyion position in glycerol, an oxidation kinetics model of "double -weighted index " and " oxidation degree" are set up to elucidate the mechanism of lipid oxidation affected by acyl migration. The results of this study will provide a scientific basis for the synthesis of structured lipid and mechanism of lipid oxidation.

酰基迁移是酶催化合成结构脂中主要的副反应，严重影响到结构脂质的品质及其氧化稳定性。目前国内外有限的研究都是从最终反应产物的组成与结构推断酰基迁移机制，而没有从反应过程和酶催化本质上进行探讨，不能对酰基迁移进行有效调控。反应过渡态底物的确定有助于揭示脂酶催化酯交换酰基迁移机制。本项目拟以脂酶催化合成1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯（OPO）为反应体系，通过系统研究反应影响因素对脂酶催化过渡态底物结构变化，阐明结构脂酰基迁移规律，找出酰基迁移的调控方法。并以OPO、LPL、LnPLn及其酰基迁移异构体POO、PLL、PLnLn为甘油三酯模板，考虑双键含量、位置及在甘油中酰化位置等因素通过"双键加权指数"与"氧化程度"建立氧化动力学模型，揭示酰基迁移影响脂质氧化的机理和规律。通过本项目研究将为深入理解酶促酯交换生产结构脂中酰基迁移现象及对脂质氧化稳定性影响提供理论依据。

酰基迁移是专一性脂酶催化合成结构脂中主要的副反应，严重影响到脂酶催化合成结构脂的品质及其氧化稳定性。目前国内外有限的研究都是从最终反应物的组成和结构推断酰基迁移机制，而没有从反应过程和酶催化本质上进行探讨，具体反应机理亦不清晰。.首先，本项目以三棕榈酸甘油酯(PPP)和茶油游离脂肪酸(FFA)为底物基材，利用sn-1,3位特异性脂肪酶对其进行酶促酸解反应，合成OPO结构脂。考察正己烷、叔丁醇、丙酮和不同水活度(aw，0.11、0.53、0.97)、反应时间(0、2、4、6、8 h)对底物摩尔比为1:5催酶促酸解反应过程中酰基的迁移；较高和较低的水分活度和反应时间的延长、溶剂极性的降低都有利于酰基迁移。.其次，选用与母乳脂肪相似度较高的酥油为主要原料，脂肪酸乙酯为酰基供体，采用固定化脂肪酶RM IM催化，通过响应面法优化得到最佳工艺条件为：在68ºC下用10 wt%的RMIM（水活0.61）催化酥油:葵花籽油乙酯:油酸乙酯（2.13:1:1，mol/mol/mol）。并在模型验证中对其主要脂肪酸进行分析，总亚油酸以及sn-2棕榈酸的实际值分别为17.59%和56.40%，与预测值基本一致，我们的结果为合成母乳脂肪替代脂(human milk fat substitute)提供了新的原料和方案。.再者，基于密度泛函理论研究脂肪酶催化的酰基迁移途径可分为四个基本步骤：（a）双质子转移; （b）sn-1的氧阴离子对sn-2的羰基碳的亲核攻击; （c）通过双质子转移将质子反馈到基质上; （d）五元环的开口以及一个水分子穿梭的质子迁移。其中，最后一步是限速步骤其活化能垒为18.8 kcal / mol，这与从实验得到的值（17.8 kca/mol）一致。在脂肪酶活性位点中作为一般酸/碱起作用的催化三联体在催化酰基迁移中起着至关重要的作用。我们还发现，在非脂酶催化或脂肪酶催化的酰基迁移途径中，一个水分子作为质子穿梭可以显着地降低限速步骤的能垒。.最后，实验证明如果不饱和脂肪酸酰基迁移由sn-1,3位转移至甘油三酯的sn-2位则可增强甘油三酯及不饱和脂肪酸的氧化稳定性，反之不饱和脂肪酸由sn-2位迁移至sn-1,3位则降低其氧化稳定性。.通过本项目研究将为深入理解酶促酯交换生产结构脂中酰基迁移现象及对脂质氧化稳定性影响提供理论依据，还以藏牦牛酥油为原料制备OPO型母乳脂肪替代脂。