香兰素合成酶阿魏酰辅酶A连接酶（FCS）底物识别及催化机制

Vanillin is one of the most important flavoring agents with vanilla flavor. The production of vanillin through synthetic biology is of great interest because of its commercial value. The feruloyl-coenzyme A synthetase (FCS) is a crucial enzyme involved in the biosynthesis process of vanillin from ferulic acid. The catalytic efficiency of FCS to ferulic acid directly affect the yield and the productivity of vanillin. However, the substrate determining and catalytic mechanism of FCS is unknown yet. This study aims at analyzing the crystal structures of FCS from Amycolatopsis sp. ATCC 39116 in the unmodified (apo) form and in the forms complexed with ligand through X-ray crystallography, and illustrating the substrate determining mechanism of FCS by identifying the substrate binding sites, combining with site-directed mutagenesis and biochemical analysis. In addition, this project also aims at revealing the catalytic mechanism of FCS by using spectroscopic analysis and enzymatic analysis. For the first time, this work will determine the molecular mechanism of FCS in the biosynthetic process of vanillin. The deep research of FCS in this study may offer practical information at the structural and enzymatic level for the modification of FCS, and also provide theoretical basis for the biosynthesis of vanillin and the industrial application.

香兰素是一种呈香草味的重要食品添加剂，通过合成生物学的方法制造香兰素既是当下的研究热点，也具有重要的应用价值。合成途径中阿魏酰辅酶A连接酶（FCS）是合成香兰素的关键酶之一，其对阿魏酸的催化效率直接影响了香兰素的产量和合成效率。但是，该酶的理化性质、与底物阿魏酸的识别及催化机制却仍不清楚。本项目以拟无枝酸菌ATCC 39116中的阿魏酰辅酶A连接酶（FCS）作为研究对象，首先通过蛋白质X射线结晶学的方法解析FCS及其底物复合体的三维立体结构，然后结合定点突变技术和生化分析鉴定FCS的底物结合位点，阐明两者精确识别的分子机制；进而结合光谱学分析和酶学性质研究，揭示FCS催化底物的分子机制。本项目将首次阐明阿魏酰辅酶A连接酶（FCS）在香兰素合成过程中的具体作用机理，为FCS的分子改造提供结构依据，同时为香兰素的生物合成和产业化应用奠定理论基础。

香兰素是一种呈香草味的重要食品添加剂。通过合成生物学的方法制备天然香兰素，符合人们对于天然香精的食用安全要求，具有重要的应用价值。阿魏酰辅酶A连接酶（FCS）是合成香兰素的关键酶之一，其对阿魏酸的催化效率直接影响了香兰素的产量和合成效率，但该酶的理化性质、与底物阿魏酸的识别及催化机制仍不清楚。本项目以拟无枝酸杆菌ATCC 39116来源的FCS作为研究对象，首先通过克隆构建、表达纯化和酶活测定明确了其基本酶学性质，然后通过X-射线晶体学的方法解析了FCS及其与底物复合体（FCS +MgCl2+ATP+阿魏酸）的晶体结构。FCS及其底物复合体均呈现典型的腺苷酶构象，由一个较大的N-lobe和一个较小的C-lobe以及中间的柔性铰链共同组成。由于辅因子ATP在底物复合体结构中被降解成AMP，整个复合体呈现出FCS-阿魏酰-AMP的腺苷态构象。FCS与底物阿魏酸的结合主要依靠疏水氨基酸Ala201，Met205，Phe241，Met295，Pro300，将它们突变成亲水氨基酸会直接导致酶活的减弱甚至丧失。FCS与辅因子AMP的结合则有赖于疏水和亲水氨基酸的共同作用。其中，AMP的核糖与Asp375和Arg390形成氢键作用力；腺嘌呤环则被Tyr293和Gly271-Ala272-Pro273夹在中间，同时与Val387形成疏水作用力，与Gly271、Gly292、Gln291形成氢键作用力。生化分析显示，FCS催化底物的关键氨基酸并非Thr296，猜测后续辅因子CoA的加入会引起蛋白构象由腺苷态转变成硫酯态，进而引入关键的催化氨基酸，激活阿魏酰-AMP的羰基基团，引起CoA巯基基团的亲核替换，进而释放AMP。本项目通过深入研究FCS的基本酶学性质、底物和辅因子结合机制、酶催化机制，丰富和完善了香兰素生物合成领域中的酶学研究体系，为设计和制备酶学性质更好的突变体提供了重要依据。