PCSK6基因多态性与类风湿性关节炎的关联性及其致病机制研究

类风湿性关节炎(RA)最主要的病理表现之一是关节软骨损伤。软骨的主要成分蛋白聚糖的降解是造成其损伤的主要原因。聚集蛋白聚糖酶（Aggrecanase）是蛋白聚糖降解的关键酶，而Aggrecanase需要前蛋白转化酶6（PCSK6）的存在才能由前体变成有降解活性的酶。PCSK6可能与RA软骨损伤有关。我们前期工作证实PCSK6的rs3816939等3个位点及多种单体型与RA易感性相关（p<0.05）。在本项目中我们拟首先采用case-control研究方法在2000份RA患者及同等数量的对照标本中验证上述结果并筛选新的SNP；然后从蛋白和mRNA水平阐明RA滑膜组织、血液和滑液中PCSK6和Aggrecanase的表达特征，探讨二者与RA之间是否相关；最后构建PCSK6siRNA表达质粒导入RA滑膜细胞和CIA动物模型，探讨PCSK6在RA滑膜细胞炎性因子分泌和软骨损伤中的作用机制。

本研究首先采用“病例-对照”的方法对PCSK6 tagSNP与RA之间的关联性进行了研究。然后以RA的滑膜成纤维细胞RASFs为模型，采用siRNA方法沉默PCSK6在细胞中的表达，观察沉默后细胞增殖、迁移、侵袭、炎性因子分泌、细胞周期、细胞凋亡变化情况。为了进一步揭示PCSK6发挥这些生物学作用的分子机制，我们又检测了MMP2和MMP9表达、信号通路、周期相关蛋白。.结果： 采用“病例-对照”的方法，在Hapmap数据库中筛选PCSK6的tagSNP，共96个。经Illumina芯片平台的评估，其中67个tagSNPs可以定制Illumina Gloden Gate分析芯片。用267例RA、160例正常对照进行了分型，结果显示rs8029797、rs4965877和rs12592414三个tagSNPs与RA密切相关，定制ABI公司Taqman分型探针，用第二组标本1151例RA，1056例对照进行验证。结果显示rs8029797与RA相关，p=0.011。证明PCSK6与RA之间存在关联性。. qPCR和western-blotting的方法检测PCSK6在RA、OA和AS组织中的表达；结果显示， RA中PCSK6 mRNA明显高于OA（p=0.027）；在蛋白水平上，PCSK6在RA中的表达明显高于OA。. 收集关节置换手术切除的RA患者关节滑膜，体外分离原代培养滑膜成纤维细胞RASFs。用siRNA特异性沉默RASFs细胞PCSK6的表达，MTT结果表明PCSK6沉默后，细胞的增殖能力明显降低（p=0.001 ），划痕法结果显示迁移速率明显减慢（p=0.001），Transwell法结果显示侵袭能力明显减弱（p=0.001）；细胞周期结果显示能够阻断细胞周期停滞在G0-G1期；ELISA结果显示炎性因子TNF-α的表达明显降低（p=0.001）；雌激素诱导RASFs后PCSK6的表达没有明显变化。PCSK6沉默后MMP2和MMP9前体及其活性形式表达均减少；免疫荧光和western结果均显示周期相关蛋白p27表达降低。Western结果发现PCSK6沉默后磷酸化ERK 降低。. 构建CIA大鼠关节炎动物模型，用同上方法分离滑膜，体外原代培养CIA的滑膜成纤维细胞FLS。并用同样方法沉默PCSK6的表达。结果与人源结果相同。