突变型胰岛素原C43Y对胰岛素原折叠和beta细胞功能衰竭的机制研究

Studies have shown that the correct formation of three pairs of disulfide bonds in proinsulin molecules is crucial for proinsulin folding. Misfolding of proinsulin and endoplasmic reticulum stress caused by disulfide bond mismatch are closely related to various types of diabetes mellitus. Previously, our studies in vitro showed that the disulfide bond B19-A20 was the earliest and the most important disulfide bond and was responsible for the subsequent formation of two pairs of disulfide bonds and proinsulin folding. However, the molecular mechanisms of B19-A20 mismatch in diabetes remains unclear. Based on the new mutation site c.128G>A (C43Y) screened in the study of monogenic diabetes project, it is proposed to study in the cell lines and newly established C43Y mouse model, which is knock-in in the insulin gene 2 (Ins2) 19th mutation of the proinsulin B chain. We will investigate the effect of mutant C43Y on proinsulin folding, endoplasmic reticulum stress, beta cell differentiation and apoptosis in vivo, and to determine the effect of mutant proinsulin C43Y on the folding, transport, processing and insulin secretion of coexpression wild-type proinsulin, and diabetes. This study will not only allow us to better understanding of the molecular mechanisms of β-cell failure and diabetes caused by misfolded proinsulin and endoplasmic reticulum stress, but also shed new light on development of new strategies for the treatment of diabetes.

胰岛素原分子内三对二硫键的正确形成对胰岛素原正确折叠至关重要，二硫键错配所致的胰岛素原错误折叠和内质网应激与多种类型糖尿病密切相关。我们前期研究显示，二硫键B19-A20是胰岛素原折叠时最早形成且最重要的一对，对后续两对二硫键的形成和胰岛素原的折叠起决定作用，然而其错配在糖尿病中作用机理仍未阐明。基于我们前期单基因糖尿病基因检测项目中筛选到的新突变位点c.128G>A（C43Y），本研究拟在胰岛细胞系和最新建立的在胰岛素基因2(Ins2)定点敲入胰岛素原B链第19位突变-C43Y的小鼠模型，研究突变C43Y在体内外对胰岛素原折叠、内质网应激、β细胞去分化和凋亡的影响，明确C43Y突变型胰岛素原对共表达野生型胰岛素原的合成、折叠、转运、加工、胰岛素分泌和糖尿病的影响，本研究将加深对由胰岛素原错误折叠和内质网应激所致β细胞功能衰竭和糖尿病分子机制的理解，为开发新的治疗靶点提供新的思路。

胰岛素原错误折叠和内质网应激与多种类型糖尿病密切相关。我们前期研究显示，二硫键B19-A20是胰岛素原折叠时最早形成且最重要的一对，对后续两对二硫键的形成和胰岛素原的折叠起决定作用，然而其错配在糖尿病中作用机理仍未阐明。基于我们前期单基因糖尿病基因检测项目中筛选到的新突变位点c.128G>A（C43Y），本研究拟在胰岛细胞系和最新建立的在胰岛素基因2(Ins2)定点敲入胰岛素原B链第19位突变-C43Y的小鼠模型，研究突变C43Y在体内外对胰岛素原折叠、内质网应激、β细胞去分化和凋亡的影响，明确C43Y突变型胰岛素原对共表达野生型胰岛素原的合成、折叠、转运、加工、胰岛素分泌和糖尿病的影响。体外研究结果显示，C43Y突变胰岛素原在细胞中因二硫键不能正确配对而滞留在内质网中，无法分泌至细胞外，但与阳性对照C(A7)Y突变胰岛素原相比，它仅能形成较少的二硫键介导的胰岛素原复合物，与共表达的野生型胰岛素原产生较弱的分子间相互作用，显性负效应相对较弱。此外，C43Y突变胰岛素原在短时间内也不能引起明显的内质网应激，这可能与其在细胞中无法稳定表达有关。体内研究结果进一步印证了体外实验的结果，发现纯合突变小鼠葡萄糖负荷后糖耐量异常及胰岛素分泌减少，胰岛素原和胰岛素合成减少，胰岛组织对高糖刺激的反应能力下降，胰岛β细胞分泌颗粒减少、内质网肿胀、线粒体增多，β细胞成熟相关蛋白表达下调。但是，C43Y突变胰岛素原不仅自身不能形成异常的胰岛素原复合物，也不倾向于通过二硫键与PI-WT产生分子间相互作用，因此显示出较轻程度的显性负效应，导致了INS2基因C43Y突变小鼠的轻度糖尿病表型。本研究不仅阐述了C43Y突变引起轻度糖尿病表型的分子机制，而且揭示了胰岛素原分子内二硫键对胰岛素原折叠和β细胞功能影响的非平行作用。