靶向阻断胰岛素原二聚体形成界面防止由内质网应激和胰岛素原错误折叠所致的胰岛β细胞衰竭和糖尿病

Increasing evidence indicates that proinsulin misfolding and endoplasmic reticulum stress (ERS) and play important roles in the development and progression of pancreatic beta cell failure and diabetes. Misfolded proinsulin can abnormally interact with co-expressed bystander proinsulin, specifically block the ER exit of bystander proinsulin, induce/aggravate ERS, decrease insulin production, and lead to beta cell failure and diabetes. Proinsulin normally forms dimer in the ER. However, dimerization is not required for the ER exit of proinsulin. The hypothesis of this proposal is that proinsulin dimerization interface is the initial site, which the misfolded proinsulin attacks bystander proinsulin. Preventing proinsulin heterodimerization allows bystander proinsulin to exit from the ER, alleviating ERS and beta cell failure. In this project, combining computer modeling and cell biology approaches, we will identify the key site of proinsulin dimerization. Having selected small molecules that can dock to the proinsulin dimerization interface, we will test the effects of candidate compounds on the dominant negative effect of misfolded proinsulin. The compounds that can protect bystander proinsulin from the attack of misfolded proinsulin in the cells, will be further tested in the four different diabetic animal models. The underlying mechanism of the candidate compounds that can prevent/delay the development and progress of diabetes will also be explored. This study will help better understand the molecular mechanism of beta cell failure and diabetes caused by ERS and misfolded proinsulin, and provide a novel therapeutic target for the treatment of diabetes.

胰岛素原(ProInsulin, PI)错误折叠和内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress, ERS)在多种类型糖尿病的发生发展中起着重要的作用。错误折叠的PI通过与共表达的PI分子间的异常作用，特异性阻断共表达的PI从ER中的有效转出，诱导和/或加重ERS，减少成熟胰岛素的生成，诱发糖尿病。新合成的PI在ER中可形成二聚体，本课题的假设是，PI二聚体的形成界面可能是错误折叠PI对共表达PI攻击的起始位点，阻断该界面和异常二聚体的形成，可防止和/或延缓由ERS和错误折叠PI所致的β细胞衰竭。本研究应用计算机蛋白结构分析和细胞学鉴定，明确PI分子间异常作用的关键位点，在筛选出可嵌合于该位点的小分子化合物，并进行细胞学鉴定后，在四种糖尿病模型中，观察候选小分子对糖尿病发生发展的影响，及可能的作用机制。本研究将为理解糖尿病的分子机制，开发新的治疗靶点提供帮助。

胰岛素原错误折叠和胰岛beta细胞内质网应激在beta细胞功能衰竭和糖尿病的发生发展中起着重要的作用，但是错误折叠胰岛素原导致糖尿病的分子机制还有待阐明。至今为止，已有超过60个胰岛素基因突变被报道可以导致早发型糖尿病，其中有超过一半均是通过导致胰岛素原错误折叠致病，所有的这些病人均为杂合子，我们的前期工作显示，错误折叠的突变型胰岛素原可以影响共表达的野生型胰岛素原在细胞内的转运和成熟，但具体机制不明。在正常情况下，新合成的胰岛素原在内质网中形成二聚体，本课题的假设是: 胰岛素原二聚体形成界面可能是错误折叠胰岛素原对共表达野生型胰岛素原攻击的起始位点，阻断该界面可减少异常二聚体的形成，增加野生型胰岛素原的前向转运效率，减轻内质网应激和β细胞功能衰竭。在项目首先通过计算机蛋白结构分析，评估了胰岛素原分子B链的各个氨基酸在其二聚体形成过程中的作用，发现B链第16位酪氨酸对二聚体的形成至关重要。基于此，我们构建了在B链第16位含有不同氨基酸的胰岛素原表达质粒和病毒，并在不同细胞系和人胰岛中证明了B链第16位氨基酸的门冬氨酸和谷氨酸替换，可以明显减少野生型胰岛素原与突变型胰岛素原之间的异常作用，加快野生型胰岛素原从内质网向高尔基体的前向转运，减轻内质网应激，增加成熟胰岛素的生成。为了明确胰岛素原二聚体结合界面是否可以作为潜在的治疗靶点，我们应用计算机模型，筛选了1万多种小分子化合物，并对可能的小分子进行了细胞和动物水平的验证，初步结果发现，小分子化合物11-methoxycamptothecin（11-MCPT）可以增加野生型胰岛素原的前向转运效率和胰岛素的生成，并对携带胰岛素基因突变的Akita小鼠的血糖有明显的降低作用，但对于胰岛素抵抗db/db小鼠和P58IPK小鼠血糖无明显影响。本项目加深了对由胰岛素原错误折叠所致糖尿病分子机制的理解，明确了胰岛素原异常二聚体的形成在错误折叠胰岛素原显性负效应中的重要作用，提示二聚体结合界面可能作为胰岛素原错误折叠所致糖尿病的治疗靶点。