GnT-IVa通过调控β-1,4 N-糖结构介导EMT影响细胞迁移的机制研究

Epithelial mesenchymal transition (EMT) plays an important role in the development and tumorigenesis process. GnT-IVa is one of the N-acetylglucosaminyltransferase, which could catalyze the formation of the GlcNAC β1-4 branch. And the function of GnT-IVa is unclear. Our previous results showed that the change of the expression of GnT-IVa could induce the variety of the cell morphology, marker of EMT and migration. A hypothesis was suggested that the GnT-IVa→abnormal N-glycosylation→functional change of adhesion factor→EMT→cell migration. We are planing to construct the recombinant of different expression level of GnT-IVa to clearify the relation among the GnT-IVa, β-1,4 N-gkycan, EMT and migration. Furthermore, the related pathway will be analyzed to elucidate the correlations of GnT-IVa with cell migration. The results will helpful to academic value on the in-depth analysis of the mechanism of the cell biology function of the glycan and glucosaminyltransferase. And this study will be provide a new research method on the protein post-translational modification basic data for exploring.

上皮间质细胞转化（EMT）在发育和肿瘤发生等病理生理过程中发挥重要作用。GnT-IVa是N乙酰氨基葡萄糖转移酶家族成员，特异性调控N糖核心上β-1,4分支的形成，但功能不清。课题组发现当GnT-IVa表达改变时可导致细胞形态、EMT分子Marker、intergrin蛋白糖链以及运动迁移能力的改变。为此，本研究提出“GnT-IVa→细胞表面N糖基化异常→粘附因子功能变化→EMT→细胞迁移”假设，并将构建GnT-IVa不同表达水平的细胞株，研究GnT-IVa、N糖链与E-cadherin和intergrin等细胞粘附因子的关系，分析GnT-IVa调控的β-1,4 N糖链在EMT中的作用，进而阐明糖链结构影响EMT调控细胞迁移的机制。此研究对揭示GnT-IVa通过调控粘附因子糖链结构影响EMT基本生物学过程，进而调控细胞迁移具有重要的理论价值，也将为靶向药物受体以及抗肿瘤转移研究提供新的思路。

本项目根据研究计划，以肿瘤细胞表面糖链异常的机制为切入点，深入研究了GnT-IVa影响细胞运动功能的机制，获得以下结果：1）过表达GnT-IVa可以促进肝癌SK-Hep1和HuH7细胞株的侵袭和迁移，而沉默GnT-IVa后可以抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移。通过检测肝癌细胞的糖链，发现过表达GnT-IVa后β-1,4 -N-糖链显著提升，沉默GnT-IVa后糖链减少。2）利用糖芯片技术检测了493种糖蛋白的β-1,4 -N-糖链的变化情况，发现SK-Hep1/GnT-IVa和HuH7/GnT-IVa细胞中，134个糖蛋白的糖链显著上调，它们主要参与细胞死亡、免疫反应、细胞粘附等与癌症发生发展相关的生物学过程。3）当GnT-IVa过表达时，细胞中ITGB1的蛋白表达增加，β-1,4 -N-糖链增加，而敲低GnT-IVa后，ITGB1蛋白表达和糖链下降。4）在Sk-Hep1/GnT-IVa和HuH7/GnT-IVa细胞中，敲低ITGB1后细胞迁移和侵袭显著下降；而与过表达野生型ITGB1相比，过表达ITGB1糖基化位点突变的细胞迁移和侵袭能力也显著下降。5）在Sk-Hep1/GnT-IVa和HuH7/GnT-IVa细胞中，N-cadherin和Vimentin的蛋白表达显著上升，敲低 GnT-IVa后，N-cadherin，Vimentin的表达下降。而敲低Vimentin后，细胞的迁移和侵袭能力显著下降，其下游的Axl蛋白表达也下降。6）在Sk-Hep1/GnT-IVa和HuH7/GnT-IVa细胞中，敲低ITGB1后，Vimentin和AXL的表达下降，Vimentin的细胞定位发生变化。此外，与过表达野生型ITGB1相比，过表达N糖基化位点突变型ITGB1的细胞株中vimentin和AXL的表达显著下降，对vimentin亲和力也下降。裸鼠成瘤实验也证实了以上结果。以上研究表明GnT-IVa通过影响Integrinβ1的糖链和表达，引起vimentin的表达和定位变化，进而引起下游AXL信号通路的改变，促进肝癌细胞的迁移侵袭能力。此外，延伸发现NEU4 主要是通过切除CD44 糖链上的唾液酸，抑制肿瘤细胞的迁移运动能力。该研究丰富了对糖生物学的理解和认识，在深层次上解析糖基转移酶、糖链在肿瘤细胞迁移中的生物学功能，为相关疾病的靶向药物研究提供新的思路。