基于ACSSH文库技术研究饲用蜡样芽孢杆菌对肉鸡免疫作用的分子机制

Useful Bacillus has been used as probiotics, for its role in facilitating the growth of livestock, preventing and treating diseases. A lot of research show that Bacillus preparation can promote animal in specialficity and non-specialficity immune. However, the molecular mechanism of immunization haven't been reported. Suppression subtractive hybridization (SSH) is a technology for the study of differential gene expression, its characteristics are sensitive and stable, but the deformities of SSH such as the complicated procedure and some false and cDNA capacity increased is a major issue for urgent solution. The project is based on our former rearch which we have confirmed Bacillus cereus PAS38 owned the ability to promote animal immunity, we intend to adopt the new type of SSH optimized by DGGE (ACSSH) to study the differential gene expression in immune organs of broiler which are fed with Bacillus cereus PAS38, the traditional SSH mathod as control, quickly building the differential expressed gene library and screening immune response gene. Real-time RT-PCR and western blot to detect the expression of the X gene of interest mRNA and protein levels. Used the RNAi in X gene silencing technology, the function of lymphoid organs cell is detected by Real-time RT-PCR and western blot. The study elucidates the molecular regulation mechanism of Bacillus cereus promoting immunization, and provide the new techolonogy to research of differential gene expression and reveals the molecular mechanism of immune response.

芽孢杆菌制剂得到了广泛应用，具有促长、防病治病的作用。大量研究表明，饲用芽孢杆菌制剂对动物的特异性和非特异性免疫具有较好的促进作用，但对于免疫作用的分子机理，尚未见研究报道。抑制性消减杂交(SSH)是用于研究差异表达基因的技术，具有灵敏、稳定的特点，但此技术不仅程序复杂，且得到富集的cDNA 片段因克隆而出现假阳性，还有库容虚增等缺陷。本项目在前期研究已明确蜡样芽孢杆菌菌株具有促进动物免疫功能的基础上，拟采用DGGE优化SSH 技术(ACSSH)，并与传统SSH 法所构建的文库进行比对，研究饲用蜡样芽孢杆菌对肉鸡免疫器官差异表达基因，筛选免疫调节响应基因，用Real-time RT-PCR和Western blot 方法检测免疫调节新基因（X）的mRNA和蛋白水平的表达情况，应用RNAi技术研究X基因表达沉默对淋巴器官细胞相关功能，从而阐明蜡样芽孢杆菌的免疫促进分子调控机理。

益生芽孢杆菌作为微生态制剂菌种得到了广泛的应用，具有促进畜禽的生长、防病治病的作用。大量研究表明，芽孢杆菌制剂对动物的特异性和非特异性免疫具有较好的促进作用，但对于其免疫作用的分子机理，尚未见进一步研究报道。本项目通过给予肉鸡饲喂蜡样芽胞杆菌PAS38，研究其免疫作用的分子机理。结果：（1）通过构建ACSSH，在巢式引物的基础上，反复设计引物和优化PCR条件，添加10bp的“GC”夹子能够较好地扩增产物和在DGGE分离基因条带，在纯化、回收并测序条带中，测序成功的条带双峰占比大达77%以上，而完全单一的单峰条带仅为23%。对可测序与分析的条带中，大量的是相同基因，有69% 的ESTs 都是PAX5基因，14% 为SRSF3基因，9% 为LARP1B基因，结果表明，ACSSH方法不可行。（2）蜡样芽胞杆菌PAS38的添加使肉鸡的体液免疫得到加强，提高试验组血清中IL-2和IFN-γ的水平，降低IL-4和IL-10的水平， GBP1、IRF1在免疫器官的转录水平高于对照组。（3）通过转录组高通量测序肉鸡脾脏免疫相关基因，仅给予肉鸡蜡样芽胞杆菌PAS38且未免疫疫苗的肉鸡中，炎症相关基因PROKR2、CTGF、DMBT1下调，具有缓解炎症，抗菌活性基因NKL和GBP1上调，抗菌活性增强；在给予肉鸡蜡样芽胞杆菌PAS38且免疫疫苗的肉鸡中，主要从非特异性免疫方面增强疫苗的免疫效果，相关免疫基因STX11、Lysozyme g、IFN-γ、Mx、LYSg、C1s、GBP1上调，结果表明，对细胞吞噬、促炎、抗病毒等功能增强，PAS38制剂能促进肉鸡免疫功能。（4）通过SSH法分析给予肉鸡蜡样芽胞杆菌PAS38且未免疫疫苗的肉鸡脾脏免疫相关基因的差异表达，获得284个克隆子，有效克隆子119个，有效基因序列为42%左右，在这有效基因序列中，通过分析获得9个免疫相关基因，其中7个上调，2个下调。（5）由于一直在构建ACSSH方法且被证明不可行，时间被虚耗，因此相关免疫基因的验证工作仍在进一步研究中。