饲用拮抗菌益生枯草芽孢杆菌MA139作用机理研究

芽孢杆菌作为益生菌在畜牧领域中替代抗生素具有广阔的前景。但存在作用效果不稳定，尤其是具体的作用机制不明的问题，从而限制了它的推广应用。芽孢杆菌的抗菌活性被推测为益生芽孢杆菌的最重要的机理，但尚无定论。本项目以饲用枯草芽孢杆菌MA139的抗菌活性为基础，拟从体外和体内两方面系统研究芽孢杆菌在动物胃肠道的作用机制。用枯草芽孢杆菌MA139与胃肠道中常见菌群乳酸杆菌和大肠杆菌K88+的共培养试验来模拟体外法研究芽孢杆菌在胃肠道的抗菌机制；用绿色荧光蛋白来标记外源的芽孢杆菌MA139，通过大鼠经口摄入，实时监控芽孢杆菌的芽孢在胃肠道的增殖和定位；以人工感染GFP标记的大肠杆菌K88+的大鼠为基础，研究芽孢杆菌MA139在体内对大肠杆菌K88+的抗菌活性以及对大鼠胃肠道健康的保护机理。本项目将为系统解释抗菌性芽孢杆菌对动物胃肠道健康保护的作用机制，为益生芽孢杆菌的进一步应用提供理论基础。

饲用枯草芽孢杆菌MA139被证实具有改善粪便菌群并提高仔猪生产性能的效果，但菌株的体外抗菌活性与体内拮抗活性之间的关系，未见报道。本课题创新点在于，采用体内和体外试验结合的办法，分别荧光标记外源的益生芽孢杆菌以及肠毒性大肠杆菌，特异性研究外源芽孢杆菌在动物胃肠道内对肠毒性大肠杆菌的抗菌机理：（1）在仔猪小肠液中，B. subtilis MA139仅在小肠前段才表现出显著的抗菌活性，并且在此位点其对乳杆菌的增殖均有一定的促进作用；（2）在标准化MRS培养基的共存试验中，在微耗氧条件下，B. subtilis MA139未表现出显著的抗菌活性，但能显著促进乳杆菌的生长，显著降低体系pH及ORP，并藉此增加了乳杆菌对E. coli K88的抗菌活性，导致体系中E. coli K88的数量显著降低；这一结果在B. subtilis MA139与L. reuteri G8-5复合固态发酵体系中得到了进一步的证实；（3）通过构建穿梭质粒分别构建了GFP表达体系，得到了在E. coli K88及B. subtilis MA139良好表达的发光及耐药性菌株，应用于大鼠体内试验中，结果表明，B. subtilis MA139的芽孢能够在大鼠十二指肠、空肠、盲肠及结肠中得到显著增殖，并在相应位点能特异性对E. coli K88产生显著的抑制作用。与体外试验结果具有一致性。上述结果证实芽孢杆菌能够增殖并能在体内特异性降低病原性大肠杆菌的活性，其拮抗活性与有益乳杆菌的活性增加有关。