囊胚培养对DNA甲基化影响的研究

Numerous epidemiological survey revealed that increased abnormal pregnancy outcomes were observed in blastocyst transfer cycles , which were featured by prolonged in vitro culture duration compared with transfer at blastomere stage. However its molecular mechanism remains unclear. Combined with our previous research and literature review, we hypothesized that epigenetic modifications may play an important role in it. In consideration of relevant researches limited at home and abroad, we design this study. By high-throughput sequencing technology, we want to analyze genome-wide DNA methylation of blastocyst in mice model obtained by different in vitro culture duration. Methylation status of differentially methylated imprinted genes and nonimprinted genes are also detected in different development stages of the embryo and placenta both in mice and human cases. This research is aimed to provide an important novel information to further understand the relationship between blastocyst culture and DNA methylation profiles and for improving culture systems and ultimately promoting the health of ART offspring.

众多临床流行病学调查显示，相对于卵裂期移植，囊胚培养体外培养时间延长，出现异常母婴结局的风险增加,但机制不明。结合我们的前期研究及文献综述，我们推测表观遗传修饰在其中发挥重要作用，但缺乏理论实证，国内外亦无相关研究。本课题建立小鼠模型，选择DNA甲基化这一重要的表观遗传修饰指标，通过高通量测序技术，分析延长体外培养时间对囊胚全基因组DNA甲基化的影响；选取差异甲基化的印记基因及非印记基因，检测其在不同发育阶段胚胎及胎盘组织的甲基化状态，在人辅助生殖病例进行实证。旨在探索囊胚培养是否会导致DNA甲基化修饰异常，以及可能干预阶段和机制，为改善IVF体外培养，增进ART子代健康提供参考。

利用少量细胞DNA甲基化建库，对体外培养以及体内发育的内细胞团、外滋养层以及整个囊胚进行了全基因组甲基化建库测序，在全基因组水平对各个组间的甲基化进行了研究。目前已经完成了六组共56个样品的全基因组甲基化测序，共有55个样本符合要求。单个样本甲基化位点的1X覆盖度在14.2M左右，覆盖基因组所有CpG的33.4%。利用非监督聚类对各个组的样本进行聚类分析，结果显示不论在全基因组整体的甲基化水平还是启动子水平聚类体外培养组囊胚与体内发育组囊胚，它们均可较好的聚集在一起，而ICM与TE并不能分开，同一个胚胎的ICM与TE会聚类到一起，提示此时的ICM与TE的甲基化差异小，主要是以培养条件进行聚类。结果反应了体内发育组囊胚与纯体外培养组囊胚存在差异。进一步比较发现体外培养组囊胚和体内发育组囊胚在基因间区、LINE、LTR等多个元件的甲基化水平存在差异，体外培养组囊胚在整体上呈一个较高的甲基化水平。同时还对可能调控基因转录的启动子区域的甲基化进行了比较，发现体外培养对基因启动子存在影响，研究发现在体外培养组中有327个基因的启动子区域的甲基化要高于体内发育组，对这些基因进行功能富集分析发现差异启动子的功能主要富集在嗅觉，信号传导，防御反应、视黄酸相应等生物学过程。对重要的印记基因的DNA甲基化进行了分析，发现体外培养组中Hg19以及Igf2r这两个重要印记基因的甲基化水平在体内发育组要高于体外培养组，提示在基因印记可能在植入前的胚胎培养的过程中受到了影响。总而言之，研究结果显示囊胚培养对胚胎DNA甲基化修饰存在，改变胚胎的表观遗传学修饰，此项研究能为改善胚胎体外培养条件，增进ART子代健康提供科学依据。