丹参酮类化合物结构修饰关键CYP450酶Miltiradiene-12-Hydroxylase的功能研究

The biosynthesis of tanshinone includes three consecutive processes: the formation of precursor, the construction of skeleton and post-modification of the skeleton. Cyclization of GGPP to miltiradiene was followed by a series of post-modification enzymes to produce various tanshinones. The first oxygenation step is the CYP450-mediated hydroxylation of the diterpene olefin precursor miltiradiene. In this study, fourteen up-regulated CYP450s were cloned for further analysis based on the transcriptome. Real-time PCR indicated that seven of them was highly expressed in the rhizome of S.miltiorrhiza. The seven candidates were functional expressed in yeast, and miltiradiene was used as substrate for catalyze analysis. RNAi was used to silence gene expression. The catalyzed characterization was further confirmed by transforming into the engineered yeast strain which produce miltiradiene endogenously. Cloning and functional characterization of CYP450 (Miltiradiene-12-Hydroxylase) catalyzing hydroxylation of miltiradiene is useful for directional genetic breeding and heterologous production of tanshinones.

丹参酮的生物合成主要包括前体形成、骨架构建和后修饰三个阶段，目前其生物合成途径已经推进到了碳骨架结构次丹参酮二烯，在此基础上通过一系列后修饰酶的催化形成结构各异的丹参酮类化合物。细胞色素P450酶介导的次丹参酮二烯羟基化反应作为结构修饰的第一步起关键作用。本项目在转录组文库的基础上克隆得到14个诱导表达显著上调的CYP450基因，通过实时定量PCR分析筛选到了7个在丹参根中表达较高的基因，利用RNAi、酵母表达和酶促反应以次丹参酮二烯作为底物对其催化功能进行研究，最后将功能基因转入内源产生次丹参酮二烯的酵母工程菌进行体内功能验证。通过筛选和功能分析得到催化次丹参酮二烯C12位羟基化的CYP450酶（次丹参酮二烯-12-羟化酶），进一步解析丹参酮生物合成途径，为定向遗传育种以及活性成分的批量生产奠定基础。

本课题在国家自然科学基金的资助下顺利完成了预期任务，并取得了丰硕成果。发表学术论文6篇，其中在PNAS（IF 9.737）、New phytologist（IF 7.672）、Molecules（IF 2.416）等高水平刊物发表SCI论文3篇；获得中国药学会科学技术奖一等奖1项；申请发明专利3项；培养博士后1名，硕士研究生2名，在读博士研究生2名。.丹参酮是中药丹参的主要有效成分之一，其生物合成途径研究对丹参酮类化合物的生成机制以及合成生物学研究具有重要意义。丹参酮的生物合成途径包括前体形成、骨架构建和后修饰三个阶段。前期研究已经将其生物合成途径推进到了其碳骨架结构的生成阶段，从次丹参酮二烯到丹参酮类需要经过多步后修饰氧化过程生成丹参酮IIA等具有生物学活性的化合物，其中次丹参酮二烯-12-羟化酶是其生物合成途径第一个重要的结构修饰酶。本项目的主要研究内容是克隆得到这一关键酶基因，为丹参酮生物合成途径的推进构建平台、奠定基础。.通过比较转录组学分析，筛选得到了14个可能参与丹参酮生物合成的关键酶基因，并通过进一步的组织表达分析筛选出6个与丹参酮积累相关的基因，利用真核表达以及体外酶促反应进行功能分析表明CYP76AH1能够催化次丹参酮二烯生成铁锈醇，并且进一步的体内RNAi以及过表达分析表明，CYP76AH1在丹参酮生物合成途径中发挥重要作用，抑制该基因的表达导致丹参毛状根中丹参酮含量显著下降。由于P450发挥功能需要有P450还原酶为其传递电子，因此本研究同时克隆得到了丹参的2个P450还原酶基因。最后，利用合成生物学方法将铁锈醇的生物合成途径以及P450还原酶基因构建至酵母菌中，实现铁锈醇的酵母基因工程菌生产，为下游研究提供基础。.P450是药用植物有效成分生物合成途径中重要的修饰酶基因，在生成具有活性的天然产物的过程中有非常重要的作用。丹参酮生物合成的后修饰过程有多步P450参与的反应，通过该基因的克隆和功能研究，建立P450基因功能研究的平台和基础，一方面为丹参酮生物合成的进一步解析提供研究基础，在此基础上本项目进一步得到了丹参酮生物合成的另外2个结构修饰P450基因。另一方面通过该项目的执行，构建了功能基因挖掘-生物合成途径解析-合成生物学生产的药用植物功能基因研究平台，为其他药用植物有效成分生物合成途径研究提供研究思路和策略。