Cbl-b/C-Cbl对CD8+DC发育的抑制作用及机制研究

Dendritic cells play very important role in initiating the immune response and maitaining the immune tolerance, immunologists cherish great enthusiasm in DC field. It is not very clear that which molecule regulates the dendritic cells to develop into different subsets so far. At present study, we aim to study the function and mechanism of Cbl-b/C-Cbl in CD8+ DC differetiation. First, we created the CD11cCreCbl-b-/-C-Cblf/f mice,and analyze the preDC and different subsets of DC by FACS.we found that Cbl-b/C-Cbl coordinated to inhibit the CD8+DC differentiation, extensively study showed that the expression of Id2 and IRF8 were decreased in dKO mice,systemic inflammations were observed, and four month dKO mice had cirrhosis of liver. Above data strongly suggest that Cbl-b/C-Cbl play essential role in development and function of DC. we plan to explore the molecular and cellular techniques to extensivly study the function and mechanism of Cbl-b/C-Cbl in DC development and regulation to some transcript factors, and the effect on DC function.

DC参与了免疫应答的启动和自身免疫耐受的维持，而一直成为免疫学家关注的重点。但其前体细胞分化成不同亚群DC的调控机制至今不甚清楚。本研究旨在探讨E3泛素连接酶Cbl-b、C-Cbl在CD8+DC分化发育中的作用和机制。首先建立CD11CreCbl-b/C-Cbl dKO小鼠，并用FACS分析dKO DC前体细胞、各亚群细胞的变化。预实验结果显示：Cbl-b/C-Cbl共同作用抑制了CD8+DC的发育。进一步研究发现Cbl-b/C-Cbl 抑制了转录因子Id2、IRF8等表达。且dKO小鼠DC有系统性炎症和肝硬化。这些结果充分提示Cbl-b/C-Cbl调控了CD8+DC的发育并影响其功能。本研究拟进一步探讨Cbl-b/C-Cbl在CD8+DC发育中的作用及其对转录因子等的调控机制，及Cbl-b/C-Cbl对DC抗原处理功能的影响。为前体DC向CD8+DC分化发育及DC功能机制提供新的线索。

Cbl 蛋白家族是一类具有RING-finger 结构域的E3 泛素连接酶，已有文献报道Cbl 家族蛋白可以作为泛素连接酶和多功能的接头分子调控了T 、B的发育和功能。但其是否参与树突状细胞（dendritic cells, DCs）发育和功能目前尚无报道。为了探索Cbl 家族是否在树突状细胞发育和行使功能过程中发挥一定的作用，我们构建了在DC中特异性敲除c-Cbl 和 Cbl-b 的双敲除小鼠（CD11c Cre+ c-Cblf/f Cbl-b-/-，dKO)、c-Cbl 单敲除小鼠（CD11c Cre+ c-Cblf/f）、Cbl-b 单敲除小鼠（Cbl-b-/-）。运用流式细胞术对双敲除小鼠、单敲除小鼠和WT（野生型）小鼠骨髓和脾脏中的DC进行免疫表型分析，我们发现在双敲除小鼠骨髓中CD8+DC 的比例和绝对数相对于单敲除小鼠和WT 小鼠明显上升；并且双敲除小鼠cDC 的比例和绝对数相对于单敲除小鼠和WT 小鼠也是明显上升的。但并不影响骨髓和脾脏中pDC 的比例和数量。为了研究在双敲除小鼠脾脏中CD8+DC是如何增多的，首先我们检测了CD8+DC的增殖和凋亡，流式结果显示当双敲除c-Cbl 和 Cbl-b 后并不影响CD8+DC 的增殖；但双敲除c-Cbl 和 Cbl-b 后CD8+DC的凋亡相比较于单敲除小鼠和WT 小鼠明显降低。同时我们还检测了pre-DC 在双敲除小鼠、单敲除小鼠和WT 小鼠的情况，流式结果显示不管是在双敲除小鼠还是单敲除小鼠骨髓和脾脏中pre-DC 并没有明显变化。进一步的研究发现当双敲除c-Cbl 和 Cbl-b 后脾脏中CD8+DC 的瞬时前体CD24+DC 的比例明显升高、数量明显增多。与此同时在体外用Flt-3L 培养双敲除小鼠、单敲除小鼠和WT 小鼠的骨髓细胞，结果发现在双敲除小鼠的培养体系中CD24+DC 的比例明显升高，说明了c-Cbl 和 Cbl-b 抑制了pre-DC 向 CD8+DC的发育。.为了研究 c-Cbl 和 Cbl-b 抑制pre-DC 向 CD8+DC 发育的分子机制，我们构建了在DC发育过程中起重要作用的转录因子、及c-Cbl 和 Cbl-b 的表达质粒。体内外实验结果提示Cbl-b 和C-Cbl可能通过调控IRF8的泛素化来抑制preDC向CD8+DC发育。同时研究发现Cbl-b、C-Cbl抑制了DC