DNA聚合酶δ在衰老和衰老相关疾病中的变化及其调控衰老的实验研究

This study is to observe the change of DNA polymerase δ in the replicative senescence of human fetal lung diploid fibroblast(2BS,WI38),and the effect of the nutrition in culture on the expression of DNA polymerase δof the cultured cells.Moreover,the expression change of DNA polymerase δ in lymphocyte of senescence-associated diseases,including the diseases associated with the deficiency of DNA damage repair,is also to be observed to analyze initially the potential of DNA polymerase δ as the marker of senescence as well as senescence-associated diseases.This study is also to prepare for the basic work of the enzyme in the usefulness of study standardization, diagnosisof the diseases, and healthy evaluatation of individual..With the transfection of the expression vector of DNA polymerase δ,the population doubling numbers(PDs), senescent phenotype, the potential of cell proliferation,the level of advanced glycation end products (AGEs) and the positive cell rates of senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) of the cells will be observed to analyze the effect of DNA polymerase δ on replicative senescence.And,the speed of DNA formation(Brdu),the DNA damage and repair ability, the telomere shortenning rate and the expression levels of senescence-associated genes of the transfected cells will also be observed to discover the passway & molecular mechanism of its delay of replicative senescence.

本研究拟观察人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS、WI38)DNA聚合酶δ增龄性表达变化及营养水平对其表达的影响,观察基因损伤修复增龄性变化遗传性疾病模型-DNA损伤修复缺陷性疾病及常见老年病患者淋巴细胞DNA聚合酶δ表达变化，初步分析其作为衰老及衰老相关疾病标志物的可能性，为衰老研究标准化、衰老相关疾病诊断及健康评估提供可靠指标。.利用DNA聚合酶δ真核表达载体转染技术等，通过观察细胞传代次数、衰老表型出现时间、细胞生长增殖能力、晚期糖基化终末产物水平、衰老相关β半乳糖苷酶阳性率等，分析DNA聚合酶δ对复制性衰老的影响；通过观察DNA聚合酶δ转染细胞DNA合成率、端区缩短速度、DNA损伤水平与修复能力、衰老主导基因表达水平等，分析揭示DNA聚合酶δ调控复制性衰老的分子通路及可能机制。

本研究首先以人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）为模型，观察了DNA聚合酶δ1、δ2增龄性表达变化，发现DNA polδ增龄性表达下降，并建立了DNA polδ表达水平与细胞代龄相关模型；进而，以北京健康人群外周血淋巴细胞为研究对象，观察了DNA polδ表达水平与供体年龄的关系，发现随供体年龄增加，DNA polδ表达水平逐步下降，且与供体年龄呈明显负相关；同时，本研究以2BS细胞为对象，以不同小牛血清浓度、不同葡萄糖浓度的培养基（DMEM）培养细胞，观察到DNA polδ表达水平不受上述营养成分浓度的影响；在次，本研究观察了相同年龄组健康人群、糖尿病人群、动脉粥样硬化人群外周血淋巴细胞DNA polδ表达水平，发现其组间无显著差异。上述研究结果初步证明DNA polδ能够作为衰老的标志物。.本研究构建了pcDNA3.1-polδ1、pcDNA3.1-polδ2，转染上述正义表达载体于2BS细胞，同时通过shRNA敲除DNA polδ1。结果发现，下调DNA polδ1细胞生长增殖能力明显下降、DNA合成率明显下降、G0+G1期细胞明显增多而S+M期细胞显著减少，说明下调DNA polδ通过减缓DNA合成速率而显著降低了细胞生长增殖能力，提示DNA polδ增龄性表达下降是细胞衰老的主要原因。同时，通过彗星实验（comet assay）研究发现，在氧化应激条件下，下调DNA polδ，DNA损伤水平明显升高，修复能力显著下降，提示DNA聚合酶δ增龄性表达下调降低了基因组损伤修复能力，这可能是DNA聚合酶δ影响复制性衰老的另一重要分子机制。.本研究观察了DNA聚合酶两个相关疾病（fanconi贫血、毛细血管扩张综合症）家系DNA polδ1、DNA polε突变情况，筛查基因包括pola1、polb、pold2、pole1、polg，在其中一个家系中发现4个内含子突变、7个外显子突变，在第二个家系中发现3个内含子突变，1个突变位于3‘-UTR下游。并以慢病毒稳转细胞系观察POLD1 EXON2 50403975 G>A(c.56G>A)突变位点的生物学功能，发现该突变可致细胞周期减慢、细胞生长增殖能力下降、基因损伤修复能力下降等。.在完成上述全部研究计划的同时，本研究组以2BS细胞为对象，观察了DNA polδ1启动子甲基化增龄性变化情况，发现了在其启动子区域存在4个甲