硫化钠解除纤维素水解物抑制丁醇发酵的靶点研究

Butanol and ethanol are two mian biomass liqiud fuels made from cellulosic feedstock. The concentration and composition of sugars in cellulosic hydrolyzate make cellulosic feedstock is more proper for butanol fermentation. Pretreatment and hydrolysis are two very important techniques, because microrganism can’t utilize lignocellulose directly. But some inhibitors originate from hydrolysis can generate a serious impact on butanol fermentation which are different from those to ethanol fermentation. Considering this, a novel method for disinhibition, adding Na2S in the fermentation medium, was developed by us. With this method, butanol fermentation from cellulosic hydrolyzate could be significantly improved without detoxication and inhibitor-tolerance strain. In this proposal, the important genes and pathways related to metabolic networks under the function of inhibitor and Na2S will be disclosed by transcriptome analysis and further confirmed by analysis of gene expression,enzyme activity and metabolite in vivo. This proposal will be a systematic study to elucidate the targets which was inhibited by the inhibitors and the role of Na2S in improving butanol fermentation of Clostridium acetobutylicum. It will not only improve our understanding for the basic biological principles of Clostridium acetobutylicum under the stress of inhibitor, but also have a great.practical potential for the further exploring and application of noval methods for the attenuation of inhibition.

纤维素原料生产的生物质液体燃料主要有乙醇和丁醇，其成分特点决定了纤维素用于丁醇发酵更具优势。纤维素利用的关键问题在于原料的高效水解，但现有预处理和水解技术均会不可避免地产生抑制物，且水解液中丁醇发酵抑制物与乙醇发酵抑制物有根本差异，产生抑制的机制也尚不清楚。我们前期开发了一种在发酵过程中直接添加Na2S解除抑制并显著提高丁醇产量的方法，但其作用机制尚不明确。本项目拟从转录水平、酶水平及代谢产物水平对纤维素水解液发酵组和人工合成培养基发酵组（模拟纤维素水解液的糖份组成、但不添加水解副产物）的丙酮丁醇梭菌进行比较研究，解析纤维素水解副产物抑制丙酮丁醇梭菌发酵的原因；通过对纤维素水解液发酵组和添加Na2S的纤维素水解液发酵组的上述靶点进行比较研究，解析Na2S解除抑制的作用机制。研究结果可为开发新的解除抑制的方法提供理论指导，且有望为其它纤维素生物转化产品的生产提供新的思路和重要参考。

纤维素原料生产的生物质液体燃料主要有乙醇和丁醇，其成分特点决定了纤维素用于丁醇发酵更具优势。纤维素利用的关键问题在于原料的高效水解，但现有预处理和水解技术均会不可避免地产生抑制物，且水解液中丁醇发酵抑制物与乙醇发酵抑制物有根本差异，产生抑制的机制也尚不清楚。本项目在前期工作基础上，开发了一种在发酵过程中直接添加硫化钠解除抑制并显著提高丁醇产量的方法，成果如下：1）从酒曲基因资源库中异源表达获得了耐酸及高温的纤维素水解酶，优化了酶解及发酵工艺，添加硫化钠后纤维二糖、葡萄糖、木糖的利用率分别提升了180.37%，26.73% 和17.38%，丁醇浓度提升了 47.63%（由5.17g/L提升到7.63g/L），ABE总溶剂浓度提升了53.50%（由9.03g/L提升到13.85g/L）。2）生理水平、转录水平、酶水平的研究结果提示：添加硫化钠可能先通过降低氧化还原电位为厌氧的丙酮丁醇梭菌生长提供了低氧化还原电位的环境，随后促进菌体生长，并促使其糖跨膜转运、糖代谢以及丁醇生成的关键基因表达量上调，导致菌体酶活提升，综合各项因素使代谢流更多地流向溶剂生成，从而降低酸的产量，增加丁醇产量。3）根据上述机制—硫化钠最初影响了发酵体系的氧化还原电位，从而发挥后续的转录调控作用。以此为突破口，比较了多种还原性物质对发酵的影响，筛选出亚硫酸钠、硫代硫酸钠等发酵促进剂，均可显著提升丁醇及ABE得率。. 除丁醇发酵微生物外，乙醇等许多大宗制品的发酵微生物都不能直接利用纤维素，必须先通过预处理将纤维素原料水解成单糖等可发酵性糖，因此也面临水解副产物的抑制问题。本项目优化了硫化钠促进丙酮丁醇梭菌发酵未脱毒纤维素水解液的技术，并阐明了相关机制，其结果有望为其它纤维素生物转化产品的生产提供新的思路和参考。. 项目发表论文3篇，申请发明专利1件，协助培养研究生3名。