木质纤维素酸预处理中酚类物质浓度预测及其抑制丁醇发酵的机理研究

The acid-pretreatment technology is one of the most widely used methods in the field of biorefinery for lignocellulosic biomass pretreatment. During this process, phenolics are derived from degradation of lignin and these compounds strongly inhibit the butanol production by influencing the metabolism of solventogenic clostridia. However, the formation characteristics of phenolics and the inhibition mechanism of Clostridium acetobutylicum for butanol fermentation under phenolic stress are not well-known. To solve these problems, a mathematical model for prediction of phenolic concentration during acid-pretreatment process will be established, and the feature of phenolic concentration will be revealed. Based on the proposed model, the optimal parameters of acid-pretreatment process could be determined. Then, the effects of phenolic stress on the cell metabolism of C. acetobutylicum ATCC 824 will be investigated by the technology of fermentation process on-line monitoring, physiological and biochemical analysis, and observation of cell morphology. Moreover, the differentially expressed genes under environmental stress will be identified by transcriptome analysis. The key genes inhibit the butanol fermentation will be elucidated by gene knockout and complementation experiments. Finally, combined with the results of physiological and biochemical analysis, the entire molecular mechanism of C. acetobutylicum response to phenolic stress will be clearly revealed. This work will not only provide theoretical basis for metabolic engineering modification in C. acetobutylicum, but also provide shoring of foundation for high-efficient bioconversion of biomass resources.

酸预处理技术是生物炼制领域应用最广泛的木质纤维素预处理方法之一，该过程中产生的酚类物质强烈抑制产溶剂梭菌的生理代谢，导致丁醇发酵性能较差。然而，酚类物质在预处理中的形成规律及其抑制丁醇发酵的机理尚缺乏充分认识。基于此，本项目拟建立玉米秸秆酸预处理中酚类物质的浓度预测模型，揭示该类物质在预处理中的浓度规律，并确定最优酸预处理工艺；进而以最优预处理工艺下产生的酚类物质作为胁迫条件，利用发酵过程在线检测、生理生化分析和细胞形态观察等手段探究其对丙酮丁醇梭菌ATCC 824生理参数的影响规律；在此基础上，挖掘胁迫环境下的差异表达基因，利用基因敲除与回补实验确证关键基因，结合生理生化分析结果阐明酚类物质抑制丁醇发酵的分子机理。研究结果为后续代谢工程改造丙酮丁醇梭菌提供理论依据，并为生物质资源高效转化提供基础支撑，具有重要的理论和实践意义。

生物丁醇作为一种高效液态燃料，因其能值高、腐蚀性低等优势受到人们的广泛关注。木质纤维素作为来源丰富的廉价可再生原料在一定程度上可以改善丁醇生产的经济性。然而，利用木质纤维素生产丁醇之前必须对其进行预处理，该过程不可避免地产生一系列副产物，其中由木质素衍生的酚类物质是抑制丁醇发酵最强烈的一类化合物，且酚类物质水溶性较差、定性定量分析困难，导致其对丁醇发酵的抑制机理尚不明确。针对以上问题，本项目聚焦木质纤维素无机酸预处理过程，以玉米秸秆为研究对象，将五个预处理条件和酶添加量作为模型输入变量，利用人工神经网络（ANN）建模技术建立了预处理中酚类物质浓度预测模型，优化后的ANN拓扑结构为6-12-2，该模型对酚类物质浓度和葡萄糖含量的预测具有良好的拟合性能（R2>0.90）；分析计算了六个输入变量对酚类物质浓度和葡萄糖含量的相对重要性，揭示了酚类物质衍生与预处理条件间的规律。研究了厌氧瓶和发酵罐中不同浓度的酚类物质对丁醇发酵的影响，提出了5 L厌氧发酵罐进行丁醇生产的pH优化控制策略。在此基础上，选取典型的酚酸（香草酸和对羟基苯甲酸）、酚醛（香草醛和对羟基苯甲醛）和复合酚类物质（香草酸、对羟基苯甲酸、香草醛和对羟基苯甲醛）为胁迫条件，基于发酵动力学、转录组学、生理生化参数变化、能量/辅因子水平、细胞形态等方面系统分析了丙酮丁醇梭菌（C. acetobutylicum）应对酚类物质胁迫的变化特征。结果表明，复合酚类胁迫对C. acetobutylicum的抑制作用与酚酸胁迫接近，酚醛胁迫的抑制作用最明显。酚类物质胁迫导致了膜转运蛋白、糖酵解途径、丙酮酸代谢、溶剂合成、热激蛋白及抗氧化活性相关基因出现差异表达，双组分体系、孢子生成和细胞分裂的相关基因也出现显著变化。研究结果揭示了木质纤维素酸预处理中酚类物质衍生特征，初步阐明了酚类物质对C. acetobutylicum丁醇发酵的全局抑制机理。本项目所取得的研究结果为代谢工程手段改造C. acetobutylicum以提高其代谢鲁棒性和耐受性奠定了理论依据。