青蒿素衍生物抗肿瘤活性靶点和机制研究

Artemisinin is a preferred drug with high anti-malarial activity, and have recently been suggested to have anti-cancer effects. However, the mechanisms of its action are still not fully understood. Based on our previous work that we have synthesized artemisinin analogues AAD-1/2 and identified their target protein Lgp1, we intend to investigate the effects of AAD-1/2 on tumor growth. The research will be directed toward examining the expression of caspase3, PARP, GRP78 or CHOP and also the phosphorylation status of eIF2 alpha, in order to test our hypothesis that AAD-1/2 induces apoptosis through ER stress. Otherwise, Lgp1-RNAi and Lgp1 overexpression will be used to confirm that Lgp1 is the target of AAD-1/2 in vivo. Thus, we will uncover a possible novel signaling pathway that AAD-1/2 causes ER stress-induced apoptosis by their interaction with Lgp1 protein, and clearly clarify their anti-tumor mechanism.

天然活性小分子化合物青蒿素是具有高活性的抗疟首选药物，并具有抗肿瘤活性。但是其作用机制尚未定论。本项目在我们前期工作合成青蒿素衍生物AAD-1/2并筛选到其作用靶点蛋白Lgp1的基础上，拟于细胞水平和动物水平观察小分子对肿瘤生长的影响；通过检测caspase3、PARP、GRP78、CHOP等的表达变化以及eIF2 alpha磷酸化状态和功能的变化，论证AAD-1/2以内质网应激（ER stress）作用方式诱导细胞凋亡的假说；同时对Lgp1进行基因敲除和过表达实验，证实AAD-1/ 2通过Lgp1靶点蛋白影响上述信号通路，揭示AAD-1/2通过靶蛋白Lgp1影响ER-stress进而诱导细胞凋亡这样一种分子信号作用途径，系统阐明其抗肿瘤活性作用机制。

青蒿素（ART）是一类从天然中草药黄花蒿中提取获得的具有过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物，是抗疟首选药物，并且具有抗肿瘤活性。然而关于青蒿素及其衍生物化合物的作用靶点和作用机制研究却知之甚少。本研究中，我们选择具有抗肿瘤活性的青蒿素衍生物氮杂青蒿素AAD-1和AAD-2作为研究的目标分子。利用T7噬菌体展示技术，分别从乳腺癌和肺癌的噬菌体cDNA文库中筛选获得靶点蛋白Lgp1。我们利用蛋白质体外结合pull down实验、表面等离子共振SPR技术以及计算生物学分子对接等多种体外相互作用方法对小分子AAD-1/2和靶点蛋白Lgp1的结合进行了验证，证明两者确实存在特异的作用关系。并且根据分子对接的数据结果提示，对Lgp1蛋白上可能影响结合的三个重要氨基酸位点R121、Q99和S54作了定点突变，再分别与小分子结合实验，得到结果R121是蛋白和分子结合的关键位点。同时，我们的体内研究结果表明，AAD-1/2能够诱导多种癌症细胞发生凋亡。AAD-1/2对h1299细胞的凋亡作用是通过提高内质网压力（ER-stress）关键蛋白eIF2的Ser51位点的磷酸化水平来诱导发生。Lgp1-RNAi的h1299细胞对AAD-1/2的药物敏感性明显减弱，这说明AAD-1/2在体内确实通过Lgp1发生作用的。由此我们揭示了AAD-1/2通过作用靶点蛋白Lgp1，影响ER-stress途径，进而诱导细胞凋亡发生，实现抗肿瘤功效的作用机制。