等离子体增强荧光检测肿瘤外泌体及在胰腺癌早期检测中的应用

Tumor-derived exosomes exist in circulation system and participate a serial of tumor development processes, thus were considered as potential biomarkers for tumor early detection. However, current exosome assays require tedious procedure and were often unspecific. Furthermore, it is even harder to directly analyze tumor-exosomes in blood. Both a high-throughput technique for exosomes in clinical samples and a suitable surface biomarker on tumor exosomes were required for the detection of tumor exosomes, both of which will be studied in our current project. Firstly, we are trying to develop a new specific fluorescence assay for tumor-exosomes based on plasmon-enhanced fluorescence (PEF) principle (PEF-Exo), which should be more sensitive and cost-effective, and thus more practical for clinical use. Secondly, based on our previous works, the membrane protein EphA2 will be investigated as surface biomarker for tumor exosomes through quantitative proteomics techniques. Finally, the PEF-Exo platform would be applied to analyze EphA2-positive exosomes in blood samples, and be further utilized for the early detection of pancreatic cancer.

肿瘤细胞分泌的外泌体能进入循环系统，参与肿瘤生理过程，可作为一种有效的癌症早期诊断标志物。但是，目前常规外泌体分析手段繁琐和缺乏特异性，直接分析血液中特定的肿瘤外泌体更是难以实现。肿瘤外泌体用于癌症筛查需解决两个问题：建立适于临床应用的高通量外泌体检测方法，以及找到合适的肿瘤外泌体表面靶点。本课题拟从这两个方面入手，解决肿瘤外泌体分析难题。一方面，利用“纳米等离子体增强荧光”原理，建立临床样本中外泌体免分离分析新方法（PEF-Exo），进一步提升肿瘤外泌体检测方法的准确性、分析通量，以及临床适用性；另一方面，在我们之前工作的基础上，通过定量蛋白质组学等分析手段，确定膜蛋白EphA2作为胰腺癌外泌体表面特异性靶点的可行性。最后结合这两方面结果，以PEF-Exo平台为分析方法，检测血液样本中EphA2阳性外泌体的含量，建立基于肿瘤外泌体的胰腺癌早期筛查新方法。

肿瘤来源外泌体被认为是极具潜力的早期诊断标志物。但是，目前外泌体的分析主要策略为总外泌体分离—破碎—组学分析，方法通量低、特异性差，阻碍了肿瘤外泌体作为诊断标志物的应用。.针对这一问题，我们基于金属纳米颗粒表面等离子体共振增强光散射原理，发展了液体样本中特定外泌体靶向高灵敏检测技术（nPES平台）。该技术利用金纳米球和金纳米棒同时识别外泌体表面的不同靶点，由于偶联在一个外泌体颗粒表面的金球与金棒距离小于200nm，产生表面等离子体共振增强散射光，从而放大了单个颗粒在暗场显微镜成像中的信号强度，增强外泌体检测的灵敏度；与此同时，多靶点同时识别的作用机制，使得同时检测外泌体特异性靶点和肿瘤特异性靶点成为可能，实现了肿瘤外泌体的特异性直接检测。方法检测限达到0.23 ng/uL，单次测试耗样量可低至1uL。.为了将上述外泌体分析新平台应用于胰腺癌的早期诊断，我们筛选了一系列胰腺癌外泌体相关的特异性靶点，并选择膜蛋白EphA2作为本项研究的主要靶点。我们将EphA2整合为nPES外泌体检测平台中三个识别靶点之一，构建了针对胰腺癌外泌体的nPES平台。通过对细胞培养液、小鼠血浆和临床患者血浆的测试，证明了所发展方法可以通过靶向CD81-EphA2-CD9三阳性外泌体，来显著性区分胰腺癌相关样本与正常样本。对更大规模样本队列的研究表明，该方法分辨早期胰腺癌与胰腺炎的特异性达到85%，目前尚无标志物达到同等水平，是一种极有潜力的胰腺癌早期筛查方案。此外，EphA2阳性外泌体与胰腺癌治疗的预后疗效具有显著相关性，也可用于胰腺癌预后监控。.综上所述，利用金属纳米颗粒表面等离子体共振增强光散射原理，我们成功构建了一种新的血浆肿瘤外泌体检测平台。通过与筛选的肿瘤外泌体表面标志物相结合，我们所建立的平台能够有效用于胰腺癌早期诊断与预后监控。该项目工作为肿瘤外泌体作为癌症早期检测标志物提供了成功的范例，也为纳米等离子体光学在医学检测中的应用提供了新的思路。