不同预处理对含内皮祖细胞的皮肤组织支架中血管新生的影响机制研究

Enhanced neovascularization in tissue engineering skin scaffolds（TESS） can lead to an improved skin regeneration rate and a decreased infection rate. Preconditioning the scaffolds can lead to a better neovascularization. In our project, we will first transfect the vascular endothelial progenitor cells(VR-EPCs)to express several pro-angiogenic factors, the transfected cells will be seeded in the scaffold; then, the scaffold complex will be preconditioned again with different in vitro and in vivo methods: 1) normoxia condition culture; 2) hypoxia condition culture; 3) shear stress condition culture; 4) hypoxia + shear stress condition culture; 5)in vivo short period subcutaneous implantation; 6) in vivo short period vessel wrapping implantation. Different preconditioning methods will be analyzed for their ability to improve skin regeneration in a skin defect mode. The mechanisms of such preconditioning will be analyzed. The project can not only provide more evidence for the clinical translation of scaffold based dermal regeneration, but also provide us new research perspectives.

促进组织工程皮肤支架中血管新生可以有效的加快皮肤再生速度和减少皮肤支架感染。通过不同预处理来提高支架中的血管生成效率是促进血管新生的关键。本项目中，为了加快支架中血管生成，我们设计将支架经过两步预处理，首先，我们将转染内皮祖体细胞（VR-EPCs）使其超表达不同促血管生成因子，这种VR-EPCs将单独或联合种植于细胞支架上；而后，此复合细胞支架将在体外或体内进行不同的再次预处理，包括：1）体外正常氧条件下共培养；2）体外缺氧条件下共培养；3）体外切应力条件下培养；4）体外缺氧+切应力条件下培养；5）体内皮下短期植入；6）体内包裹血管短期植入。预处理后的支架将移植到皮肤缺损模型中进行血管新生及皮肤再生的观察。不同预处理对体内血管新生及皮肤再生的影响将进行分析，通过对比不同的预处理在体外及体内对细胞和TESS相互作用的影响探明预处理对TESS中血管新生的影响机制。

研究表明，血管内皮祖细胞（VR-EPCs）在体外培养时具有分化成内皮细胞（EC）并形成毛细血管样微血管的能力，另外VR-EPCs不仅存在于成熟的血管壁中，而且还可以在一定的刺激下增殖并转移到新的环境中以形成新的血管。通过不同预处理来提高支架中的血管生成效率是促进血管新生的关键。在本研究中，通过探索各种预处理方法，最终锁定切应力、葛根素与丙酮酸激酶肌同工酶2（PKM2）在影响血管内皮祖细胞的增殖、迁移、分化中起到重要作用；本研究通过cck8细胞增殖及毒性检测实验、细胞划痕实验、实时荧光定量RT-qPCR 检测技术及体外血管生成实验等证实（1）切应力能促进VR-EPC 分化，增强其体外成血管能力，该过程可能是由YAP 蛋白介导来实现的；（2）葛根素可促进血管内皮祖细胞增殖、迁移、分化以及以及体内促进缺血皮肤中血管生成，其可能机制是通过激活VEGF/VEGFR2介导的PI3K/Akt和PLCγ/Erk信号通路，使Akt和Erk磷酸化水平升高从而促进血管内皮祖细胞增殖、迁移、分化及血管生成；（3）小分子活化剂DASA-58显著增加PKM2表达，使其主要通过发挥激酶活性和促进糖酵解途径加速VR-EPCs迁移、侵袭和血管生成，同时促进线粒体融合，使线粒体膜电位轻度升高。 特异性抑制剂Compound 3k（C3k）降低PKM2的表达，抑制其激酶活性并抑制糖酵解，促进线粒体分裂，降低线粒体膜电位和抑制线粒体功能，导致细胞内ROS水平升高，从而抑制VR-EPCs迁移，侵袭和血管生成。（4）证明了人类指甲存在干细胞/前体细胞，这或许为皮肤干细胞亚型。确定了这些预处理对体内血管新生及皮肤再生的影响，并阐明了其中对血管新生的影响机制，为临床转化提供一定基础。